利用转基因动物乳腺生物反应器生产溶栓药物的研究进展

目前 ,溶栓试剂主要有七大类 ,其中 ,纤溶酶原激活剂 ( PA)及其突变体是急性心肌梗塞的常规用药 ,但是由于来源有限 ,价格昂贵 ,远远不能满足临床需要。利用转基因动物乳腺作为生物反应器来生产溶栓药物能够降低成本 ,是一种高效率的表达系统 .转基因动物乳腺生物反应器是将目的基因构建于乳腺表达载体 ,通过显微注射等方法注入动物的受精卵中 ,使目的基因整合到动物的染色体中 ,最终在动物乳汁中获得目的蛋白的一种制药方法。到目前为止 ,转基因组织型纤溶酶原激活剂 ( t PA) ,尿激酶型纤溶酶原激活剂 ( u PA) ,长效组织型纤溶酶原激活剂 ( LAt PA)的转基因小鼠 ,及长效组织型纤溶酶原激活剂 ( LAt PA)的转基因羊都已产生 ,并且在从转基因羊乳汁中纯化长效组织型纤溶酶原激活剂 ( LAt PA)蛋白方面也取得了突破性的进展。可以预测 ,利用转基因动物乳腺生物反应器生产溶栓药物将会有广阔的前景。

老年痴呆症转基因小鼠模型研究进展

老年痴呆 (AlzheimerDisease ,AD)最明显的两个病理特征是蚀斑 (Plaque)和神经纤维团 (Neurofib rillaryTangle ,NFT)。现在发现与AD密切相关的基因有APP ,PSI ,PSII,apoE等基因。针对这些基因 ,研制了转基因小鼠 ,力图模拟临床病理情况 ,为疾病研究提供有益的模型。文章综述了这些转基因小鼠模型的基因构建及病理特征。

乙基亚硝基脲诱导转基因小鼠基因突变的研究

[目的 ]用乙基亚硝基脲 (ENU)进一步验证携带xylE基因的转基因小鼠在体内基因突变研究中的应用价值。 [方法 ]用ENU对转基因小鼠进行诱变处理 (i.p .5 0mg/(kg·d) ,连续 5d)后 ,从脾脏组织DNA中回收带有靶基因xylE的pESnx质粒 ,通过电穿孔法转化大肠杆菌 ,筛选突变体 ,检测突变率 ,并对突变靶基因进行测序分析以确定突变类型。 [结果 ] (1)ENU诱发转基因小鼠脾脏组织xylE基因的突变率为 1 2 48× 10 -4 ,显著高于自发突变率 ;(2 )ENU诱发基因突变的类型包括碱基的颠换、转换以及由于碱基的缺失或插入所引起的移码突变。 [结论 ]该转基因小鼠是检测体内基因突变的一种有效的动物模型。

条件性基因打靶技术研究进展

以胚胎干细胞技术和同源重组技术为基础的基因打靶技术 (genetargetingtechnology)在先后经历了以自身作为选择标记的同源重组 ,采用正负选择系统的同源重组 ,和进行靶位精细操作的同源重组等 3个阶段后 ,很快发展成为一种日臻成熟的基因操作技术 ,广泛应用于发育生物学、基因功能研究、医学病理模型的建立、基因治疗方法学的研究以及转基因动植物和生物反应器的制备等多个领域。尤其位点特异性重组酶体系如Cre loxp体系在基因靶位操作技术中的应用 ,使得对基因修饰进行精确的时空调控成为可能。

c-Ha-ras转基因小鼠的构建与鉴定

采用 ＰＣＲ和定点突变的方法获得 ｃ－Ｈａ－ｒａｓ突变基因，将其克隆到ｐｃＤＮＡ３载体上，得到含有 ｃ Ｈａ－ｒａｓ６１密码子突变和核苷酸 ２７１３突变的质粒 ｐｃＤＮＡ３－ｒａｓ２。对重组质粒进行瞬时表达，Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测到强阳性条带。酶切重组质粒，回收含有ＣＭＶ启动子－目的基因－下游调控序列的４．３ｋｂ片段，然后将其显微注射到１ＣＲ小鼠受精卵中。将注射后的受精卵移入假孕母鼠的输卵管进行母体孕育。小鼠出生３周后，ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈ－ｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测证实有４只小鼠基因组中整合了外源ｃ－Ｈａ－ｒａｓ突变基因。上述结果表明已成功构建了 ４只 ｃ－Ｈａ－ｒａｓ转基因小鼠。

小鼠bcl10基因敲除载体的构建

根据已知的cDNA序列设计引物 ,通过RT PCR获得小鼠bcl10基因cDNA片段作为探针 ,用噬斑原位杂交法克隆 12 9品系小鼠的bcl10基因组DNA ,在亚克隆完成序列结构分析的基础上 ,利用常规分子克隆技术 ,构建完成了针对bcl10基因的替代型基因敲除载体。两条同源臂分别为bcl10基因exon3上游 2 .4kb和exon4下游 4 .5kb的基因片段。构建完成替代型小鼠bcl10基因敲除载体 ,为后续获得bcl10基因缺陷型胚胎干细胞系奠定了实验基础。

重组人瑞替普酶基因在山羊胎儿成纤维细胞β-酪蛋白基因座的定点整合

目的 :利用体细胞基因打靶技术来获得定点整合有重组人瑞替普酶 (rPA)的山羊胎儿成纤维细胞株。方法 :构建了针对山羊 β- 酪蛋白基因座的定点打靶载体 ,其上游同源臂为 β 酪蛋白启动子端同时包含其信号肽编码区长约 6 .1kb的基因组片段 ,下游同源臂为 3.3kb从 β- 酪蛋白外显子 6至外显子 9的基因组片段。rPA小基因起始密码子位于 β- 酪蛋白信号肽编码区下游。将载体瞬时转染C12 7小鼠乳腺癌细胞 ,并通过激素进行诱导 ,酶联免疫吸附分析 (ELISA)检测细胞培养上清中的rPA表达量来验证载体表达功能。将载体通过电穿孔的方法转染同基因型的山羊胎儿成纤维细胞。利用G4 18和GANC进行药物筛选 ,并通过PCR和southern杂交的方法进行基因组DNA检测。结果 :获得了一株定点整合的细胞克隆 ,绝对基因打靶效率为 2× 10 7。结论 :本实验结果为后续利用核移植技术制备乳腺生物反应器提供了坚实的实验基础。

人血清白蛋白的仿生亲和配基研究

目的 研究人白蛋白特异的仿生亲和配体和仿生亲和分离技术。方法 合成固定化亲和配体库 ,以人血浆为原料筛选 ,进行人白蛋白分离实验。结果 筛选出两个可以特异结合人血清白蛋白的亲和配体。其中 3 氨甲基吡啶配位体对白蛋白的一步纯化倍数为 18倍 ,回收率 87.5 %。结论 固定化 3 氨甲基吡啶可以特异结合人血清白蛋白。

人白蛋白与3-氨甲基吡啶相互作用的研究

目的 研究人白蛋白与 3 氨甲基吡啶 (潜在的亲和配体 )之间的相互作用规律。方法 在不同酸碱度和盐浓度的缓冲液条件下将固定化 3 氨甲基吡啶与人血浆中的白蛋白接触 ,测定 3 氨甲基吡啶对人白蛋白的结合量。用亲和毛细管电泳方法测定了液相状态下白蛋白与 3 氨甲基吡啶相互作用的亲和常数及结合位点的数目 ,并与固相状态下的作用机制进行了比较。最后用计算机辅助分子模拟的方法 ,在白蛋白三级结构上搜寻可能的结合位点 ,结合实验数据阐明相互作用的机制。结果 在 pH8.0时结合量最高 ,并随 pH升高和降低而减少 ;结合的量随盐浓度的增大而减少 ,潜在结合口袋区域存在ASP2 5 6 ,ASP2 5 9两个带电荷的氨基酸残基。结论 静电相互作用是白蛋白与 3 氨甲基吡啶的结合的主要动力 ,吡啶环的疏水性质和空间体积的排斥性质可能决定了白蛋白与 3 氨甲基吡啶相互作用的专一性。

TAR载体克隆染色体目的片段的研究进展

分离染色体DNA上的目的片段 ,对其进行结构及功能的分析 ,对于发现新基因 ,研究基因功能都具有很大的意义。利用TAR克隆技术可以直接从基因组中分离所需的目的片段 ,这比传统的通过筛库获得目的片段的方法简便、快速。

B型超声妊娠诊断技术在布尔山羊胚胎移植产业化中的研究应用

应用B型超声断层扫描仪对 2 79只布尔山羊胚胎移植受体白山羊和 87只自然交配布尔山羊进行早期妊娠检查。在胚胎移植后 2 0～ 10 0天试验羊妊娠诊断阴性 (B超判断未怀孕 )的准确率为 10 0 % ;正常交配羊妊娠诊断阳性 (B超判断怀孕 )的准确率为 10 0 % ;部分胚胎移植后 2 0天左右的受体羊出现假阳性 ,这可能与胚胎移植后胎儿发育停止或出现流产或手术造成的粘连有关。试验证明 ,在胚胎移植 (2～ 8细胞胚胎 ) 30天以后进行B超妊娠检查 ,不仅可准确判断妊娠情况 ,而且能得到胚胎移植羊流产或妊娠中止的数据 ,试验说明 。

致病性大肠杆菌对庆大霉素的耐药性研究

将致病性大肠杆菌(E.coli)标准菌株C83907接种在含庆大霉素药物4种浓度的普通琼脂平板上进行细菌传代,同时设对照板传代,对各代次细菌分别进行纸片琼脂扩散法和最小抑菌浓度法(MIC)的药敏性测定。用3种不同代次的细菌感染3组小白鼠,发病后对其治疗。结果显示,各代次细菌经琼脂扩散法的抑菌圈直径由大变小,最小抑菌浓度由小变大,致病后的小白鼠治疗效果明显降低。从而表明,细菌长期处于药物环境中,会逐渐产生对该药物的耐受性。

用FSH-PGF_(2a)-Gn-RH法对波尔山羊进行超数排卵的研究

ＦＳＨ－ＰＧＦ２ａ－Ｇｎ－ＲＨ法是目前波尔山羊种质扩繁与推广生产中常用的一种超数排卵法（简称超排）：该法是由ＦＳＨ、ＰＧＦ２ａ，Ｇｎ－ＲＨ三种激素按一定配比经肌肉注射于羊体内，人为诱发卵巢上的多卵泡发育并排出具有受精能力的卵子。本文就按ＦＳＨ－ＰＧＦ２ａ－Ｇｎ－ＲＨ法的三个不同剂量配比水平时１５头波尔山羊进行超数排卵试验，结果表明：Ｉ剂量配比超排效果最好、Ⅱ剂量配比最差。

细胞核移植牛供质卵母细胞研究现状

核移植牛的研究具有巨大的经济价值，国外对此的研究不断深入，但国内开展此项研究相对滞后。本文就牛卵母细胞的成熟、去核与激活作一综述，重点介绍目前国外常用的方法，包括其效率和影响因素，其中涉及到一些常用的参数，这对从事核移植牛的同仁们会有一定的参考价值。

乳腺生物反应器表达载体的检测方法

乳腺生物反应器研究和开发的周期长 ,成本大 ,风险高 ,在生产转基因动物之前有必要对乳腺特异性表达载体构建的合理性和有效性进行检测。综述了国内外载体检测研究的进展 ,以及这些检测方法在转基因小鼠。

肌注前列腺素提高非繁殖期树鼩的受孕率

为研究前列腺素 ( PG)对于提高非繁殖期树鼠句发情及受孕率的作用 ,对野外捕获的笼养雌性树鼠句肌注 PG,并与雄性树鼠句交配 ,结果能明显地提高树鼠句的发情和受孕率。这为实验室大规模繁殖树鼠句提供了实验依据。

山羊β-酪蛋白的分离和抗体的制备

目的 纯化山羊奶中的 β 酪蛋白 ,并制备多克隆抗体。 方法 用DEAE阴离子交换层析分离羊奶中的 β 酪蛋白 ,将其免疫新西兰兔 ,免疫印迹分析分离的兔血清。结果 测序结果验证了分离产物为山羊 β 酪蛋白 ,ELISA检测表明获得了高效价的抗血清 ,免疫印迹分析表明 ,制备的抗血清可与羊奶中的 β 酪蛋白发生特异的免疫反应。结论 获得了兔抗山羊 β

添加喷雾干燥血浆蛋白粉饲喂仔猪试验

仔猪在断奶前后饲喂含有一定比例的喷雾干燥血浆蛋白粉 ,仔猪个体平均增重比不添加的提高2 4 5%,饲料转化率提高 1 7 7%,每千克饲料增重成本降低 2 2 1 %,采食添加猪血浆蛋白粉饲料后的仔猪 ,其粪便细菌总数在

两种快速筛选重组阳性克隆的方法

在分子克隆工作中 ,建立了两种简捷的鉴定含重组质粒菌落的方法 :质粒快速鉴定法和PCR鉴定法。以对人的组织纤维溶酶原激活剂 (t PA)的cDNA克隆为例。测序结果表明这两种方法能快速 ,准确地筛选出阳性克隆。

微细胞介导的染色体转移技术及其应用

微细胞介导的染色体转移技术(MMCT)是一项利用微细胞将外源染色体转入受体细胞的技术。该技术是在细胞融合的基础之上发展起来的,是细胞融合技术的进一步细化,在当代生物的若干领域里得到了广泛的应用。一些肿瘤抑制基因、端粒酶抑制基因、诱导衰老基因以及DNA修复基因都是通过MMCT技术取得细胞内识别和定位,由此促进了针对这些基因的功能研究,并为相关疾病的治疗提供了依据。同时,MMCT技术也为其他领域如表观遗传学、基因组印迹、哺乳动物人工染色体等方面的进一步研究提供了有力的手段。与体细胞核移植技术结合,MMCT还可用于建立具有重要医学药用价值和优良农业生产性状的转染色体动物,显示其具有广阔的应用前景。本文概述了MMCT技术及其在相关领域的应用与发展趋势。