木犀草素通过激活GSK3β/Nrf2通路抑制感染性炎症反应的研究

目的观察木犀草素对流感病毒感染引起的细胞炎症反应的影响,探讨木犀草素调控流感病毒引发的免疫反应的作用机制。方法①用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测不同浓度木犀草素(5、10、25、30μmol/L)对小鼠巨噬细胞RAW 264.7存活率的影响。②咪喹莫特(R837)刺激RAW 264.7或原代腹腔巨噬细胞的同时,用不同浓度木犀草素(5、10、20μmol/L)干预细胞3、6、18 h后,用荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法和酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、β干扰素(IFN-β)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)以及血红素加氧酶-1(HO-1)基因及TNF-α、IL-6的表达水平。③R837刺激RAW 264.7细胞的同时,用不同浓度木犀草素(5、10、20μmol/L)干预细胞1、3 h,用Western blot法检测细胞核因子-κB(NF-κB)p65蛋白、磷酸化p65(p-p65)蛋白、磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)蛋白、Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)和核内核因子红细胞2相关因子(Nrf2)蛋白的表达水平。④用Nrf2抑制剂(ML385)处理RAW 264.7细胞12 h后,加入R837和木犀草素(5μmol/L)继续培养6 h,用RT-qPCR法检测细胞IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-β、IP-10 mRNA的表达水平。⑤流感病毒A/PR/8(PR8)感染A549细胞2 h,同时用不同浓度木犀草素(5、10、20μmol/L)处理细胞10 h,用RT-qPCR法检测细胞IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-β、IP-10和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表达水平。结果①30μmol/L以内各浓度木犀草素对RAW 264.7细胞存活率没有明显影响(P>0.05)。②木犀草素能够显著降低R837诱导的RAW 264.7细胞IL-6、TNF-α的表达水平和IL-1β、IFN-β、IP-10 mRNA表达水平,且木犀草素也能显著降低原代腹腔巨噬细胞IL-6、TNF-α的表达水平。③木犀草素可以促进Nrf2入核,上调HO-1 mRNA表达并抑制p-p65表达,促进糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的磷酸化。④在R837诱导的巨噬细胞炎症反应中,ML385可恢复木犀草素抑制的RAW 264.7细胞炎症因子IL-6、IL-1β、IFN-β和IP-10 mRNA的表达水平。⑤木犀草素抑制PR8感染引起的A549细胞炎症因子的产生。结论木犀草素可通过抑制GSK3β活性促进Nrf2/HO-1通路,从而抑制流感病毒感染引起的炎症反应。

热毒宁注射液通过抑制肺脏炎症细胞浸润和降低细胞因子风暴保护流感小鼠

探讨热毒宁注射液(Reduning Injection, RDN)对流感病毒A/PR/8(PR8)感染小鼠的保护作用,以及对人工合成的单链RNA(R837)诱发的炎症反应的影响。将雌性C57BL/6小鼠随机分为磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline, PBS)组、PR8感染组、PR8感染后阳性对照药物奥司他韦(oseltamivir, OSV)治疗组(OSV,30 mg·kg^(-1))、PR8感染后RDN治疗组(RDN,1.5 mL^(-1)·kg^(-1))。OSV治疗组和RDN治疗组分别灌胃和腹腔注射相应剂量药物,每天1次,连续给药7 d。每天记录小鼠体质量,连续16 d,制作小鼠体质量变化折线图,分析RDN对流感小鼠体质量的保护作用。用流式细胞术分析病毒感染后小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞群改变情况,并用PCR法检测各组小鼠肺组织中炎症因子白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素1β(IL-1β)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP-2)、干扰素诱导蛋白(IP-10)和白细胞介素10(IL-10)等mRNA的表达。将小鼠巨噬细胞系RAW264.7铺板,加入不同浓度RDN(150、300、600μg·mL^(-1)),培养并观察24、48 h,用CCK-8法检测细胞的增殖情况。在RAW264.7和小鼠原代腹腔巨噬细胞培养体系中,加入R837刺激细胞,模拟病毒感染诱导的炎症反应,同时用RDN进行干预,qPCR和ELISA法检测相关细胞因子的表达情况。与模型组相比,RDN治疗组小鼠体质量下降得到了一定程度的保护(P<0.05)。RDN治疗组小鼠肺指数及肺脏中炎症因子IL-6和TNF-α、趋化因子MCP-1和MIP-2等显著低于模型组(P<0.05)。流式细胞术分析发现与模型组相比,RDN治疗组小鼠BALF中巨噬细胞比例明显减少(P<0.05),T细胞比例得到了显著恢复(P<0.001)。CCK-8细胞增殖实验中,150、300或600μg·mL^(-1)的RDN对巨噬细胞的增殖无明显影响。在R837诱导的巨噬细胞炎症反应中,RDN能够显著降低细胞因子IL-6、TNF-α、MCP-1、IL-1β、IP-10、RANTES和IL-10的表达量。综上所述,RDN能够缓解流感小鼠的体质量降低,有效降低肺脏中炎症因子水平,并且降低炎症性巨噬细胞比例,提示RDN可能抑制流感小鼠体内过度的炎症细胞浸润和降低细胞因子风暴的形成、缓解流感病毒感染导致的T细胞耗竭,从而减少继发感染的发生,防止演变为重症感染。在体外实验中证实,RDN可降低炎症因子的表达。该研究阐明RDN可能通过降低体内巨噬细胞数量和抑制巨噬细胞的炎症反应来缓解细胞因子风暴的严重程度,从而保护流感病毒感染小鼠。