动物源性食品中弓形虫Nested PCR-RFLP分子检测技术的建立

目的 为了建立一种快速、特异、灵敏检测动物源性食品中弓形虫的技术。方法根据原虫rDNA的部分序列，找出弓形虫和新孢子虫共同保守DNA片段，设计套式PCR两对引物，以Ultra Pure^TM基因组DNA快速提取试剂盒提取弓形虫和新孢子虫DNA为模板，初步建立了检测两种虫体的NestedPCR技术。将纯化的Nested PCR产物成功地克隆到pGEM-T-easy载体中，经鉴定、测序并进行同源性分析。结果 Nested—PCR的外、内引物对两种虫体rDNA基因均能进行扩增，长度分别在800～900bp、400～500bp之间。内引物扩增DNA序列与公布的同种虫体DNA序列同源性较高，弓形虫和新孢子虫分别达99.1％、97．2％，但它们两者之间差异较大，同源性仅为86．6％。用软件寻找能区别两者基因序列差异的酶切位点，挑选内切酶进行RFLP实验，结果表明新孢子虫NestedPCR扩增片段能被Vspl酶切。同时进行该分子检测技术的特异性和敏感性试验，实验证明该NestedPCR能对弓形虫和新孢子虫rDNA基因进行特异性的扩增，而对其它原虫基因未能扩增出任何片段；该Nested-PCR能检测出100个弓形虫速殖子／g猪肉。结论 本实验建立NestedPCR检测方法不仅可用于检测动物性食品中弓形虫，而且能明确区分弓形虫和新孢子虫。