表面等离子共振(SPR)技术在生物药物质量控制中的应用前景

表面等离子共振(SPR)技术是近年来飞速发展的一种新型光学分析技术,该技术在化学信号检测、生物药物分析、环境监测等多领域具有极大的应用价值。本文介绍了表面等离子共振技术的基本光学原理及常用的生物传感器,对表面等离子共振技术在生物药物分析和质量控制中的研究进展做一综述,并对该技术在生物药物质量控制领域的应用前景做一展望。

多属性分析方法应用于治疗类抗体药物质量控制的考量与前景

近年来,包括治疗类抗体在内的治疗类蛋白产品已成为现代生物制药的主力军。然而,此类产品具有复杂的产品质量属性,在一定程度上限制了产品的研发与质控(quality control,QC)。随着高分辨质谱技术的发展,基于质谱的多属性分析(multi-attribute method,MAM)具有多种产品质量属性的直接检测以及杂质的鉴别能力,其在产品的研发及QC中的重要作用逐渐显现。鉴于MAM有助于促进药品质量及QC水平提升、生产成本降低,为了探索MAM在研发和QC中的应用,本文从MAM的基本流程、在生物制药领域研发与QC中的应用、FDA对MAM在QC中应用的考量以及面临的机遇与挑战进行了介绍。以期为MAM在我国治疗类抗体药物中的应用提供思路,并为其在QC中更好的开发、使用、替代传统方法奠定基础。

人血白蛋白及人免疫球蛋白类制品的纯度测定

目的:比较琼脂糖凝胶电泳法、毛细管区带电泳法与中国药典品种项下规定的醋酸纤维素薄膜电泳法测定人血白蛋白及人免疫球蛋白类制品纯度的结果差异。方法:将人血白蛋白及人免疫球蛋白类制品均制备成蛋白浓度为5%的溶液,分别采用全自动醋酸纤维素薄膜电泳仪、全自动琼脂糖凝胶电泳仪及全自动毛细管电泳仪进行测定,均以峰面积归一化法计算纯度。结果:除毛细管区带电泳法测得的人血白蛋白大部分结果不符合中国药典2015年版品种项下的标准限度外,另外两种方法测得的人血白蛋白结果及人免疫球蛋白类制品3种测定方法的结果均分别符合中国药典2015年版品种项下的标准限度。结论:初步判定琼脂糖凝胶电泳法和毛细管区带电泳法均可用于人血白蛋白及人免疫球蛋白类制品的纯度的测定。

关于药品监管机构数据完整性规范/指南的解读

目的了解药品监管机构在数据完整性方面要求的新动态。方法解读国内外主要药品监管机构数据完整性规范/指南。数据完整性作为药品质量体系中最关键的内容,药品监管机构均出台了相应的规范/指南对其进行重点强调。规范/指南旨在提供有关数据管理和完整性的关键原则的基本概述,并且根据审查机构的反馈包括监管机构、企业提供的经验等,规范/指南定期更新、修订和审查。结果与结论本文总结了6个国内外主要药品监管机构数据完整性规范/指南的阐述角度和侧重内容,对部分概念进行了解释区分,有助于对规范/指南的理解和应用。

HL60-IL6单核细胞活化反应法在注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ热原检测中的应用研究

目的:探讨HL60-IL6单核细胞活化反应法在注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ热原检测中的应用。方法:参照2015年版中国药典通则1193,确定注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ热原测定限值及最小有效稀释浓度。采用细胞增殖抑制试验、IL-6 ELISA试剂盒干扰试验和热原干扰试验分别探讨对HL60细胞生长、对IL-6和热原测定无影响的供试品浓度,进而确定适用于注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ体外热原测定的HL60-IL6方法。用该方法对1个厂家7批注射用肝水解肽、1个厂家6批注射用辅酶Ⅰ进行热原测定。结果:注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ最小有效稀释浓度分别为0.003 mg·ml^-1和0.0002 mg·ml^-1;对HL60细胞增殖无影响的最高浓度分别为1 mg·ml^-1和10 mg·ml^-1,对IL-6和热原测定无影响的最高浓度均为0.1 mg·ml^-1。根据以上实验结果确定了适合该方法的注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ浓度均为0.1 mg·ml^-1。用该方法对1个厂家7批注射用肝水解肽、1个厂家6批注射用辅酶Ⅰ供试品进行热原测定,结果均为阴性。结论:HL60-IL6方法适用于注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ热原测定。

国产胰酶肠溶片的质量研究与风险分析

研究国产胰酶肠溶片的质量,分析产品目前存在的质量风险和质量标准中需要完善的指标。按照《中华人民共和国药典》2015年版二部的法定方法对全国范围内抽验的49批样品进行检验,并结合探索性质量研究,主要包括溶出度、罩泡密闭性、水分、残留溶剂、效价测定、种属鉴别等,对性状不合格的原因及反映的质量风险进行深入探究。对国产制剂与进口参照制剂进行了效价测定和溶出曲线的一致性评价,论证了将绝对效价测定方法修订为相对效价测定方法的必要性。通过分析认为本品主要在有效性上存在风险隐患,我国药典标准较为简单,应增订溶出度、水分,修订效价测定等影响产品质量的关键检测指标,为标准完善和改进产品质量提供参考依据。

PCR鉴定骨肽类制剂中动物源性成分

目的基于分子鉴定技术建立适用于骨肽类制剂的种属鉴定方法,并对部分国内骨肽类制剂生产企业所使用的骨骼原材料的种属来源进行鉴定。方法以骨肽生产过程中的热压提取中间体作为供试品,采用优化的CTAB法提取核酸,通过PCR扩增、琼脂糖凝胶甴泳进行动物源性成分鉴定。结果采用成功建立的适用于骨骼热压提取中间体的鉴定方法对9家企业的样品进行检测,均只检出猪源性成分,未检出牛或羊源性成分。结论 9家企业均使用猪骨作为骨肽类制剂的原材料,符合相关药品标准觃定。

唾液酸对人卵泡刺激素生物活性评价的影响

为了研究唾液酸对人卵泡刺激素(hFSH)生物活性的影响,本试验采用基于人卵巢颗粒样肿瘤细胞(KGN)的体外生物活性测定法和雌幼大鼠卵巢增重的体内生物活性测定法,测定经唾液酸酶酶切处理前后的重组人卵泡刺激素(rhFSH)和高纯度尿提取人卵泡刺激素(uhFSH)的体外、体内生物活性。结果表明,经唾液酸酶酶切处理后的rhFSH和uhFSH体内生物活性均丧失,并且唾液酸含量与hFSH体外生物活性呈负相关。通过进一步研究唾液酸酶酶切前后hFSH刺激与转染卵泡刺激素受体的中国仓鼠卵巢细胞(FSHR-CHO)中环磷酸腺苷(cAMP)生成量的关系,观察到唾液酸含量越低,cAMP生成量越高,为研究hFSH中唾液酸含量对其生物活性的影响提供参考。

呼吸信号检测的快速微生物方法应用于细胞制品无菌检查的研究

目的评价基于呼吸信号检测原理的VersaTrek■快速微生物检测系统作为药典替代方法用于细胞制品无菌检查的可行性。方法以CAR-T细胞为应用对象,参考中国药典2015年版通则9201和其他国外指导原则,研究快速方法在专属性、检测限、重复性和耐用性方面是否可替代药典方法。结果各参数的验证结果表明快速方法不劣于药典方法。结论在经验证的前提下,VersaTrek■系统可作为药典无菌检查的替代方法用于特定细胞产品的快速放行。

HL60-IL6法在注射用胶原酶和尿激酶热原检测中的应用研究

目的探讨HL60-IL6单核细胞活化反应法在注射用胶原酶和尿激酶热原检测中的应用。方法参照中国药典2015年版通则1193,确定注射用胶原酶和尿激酶最小有效稀释浓度。通过细胞增殖抑制试验、热原干扰试验和白介素-6(interleukin-6,IL-6)干扰试验探讨对HL60细胞生长,对热原和IL-6测定无影响的供试品浓度,进而确定适用于注射用胶原酶和尿激酶体外热原测定的HL60-IL6方法。用该方法对2批注射用胶原酶、19批注射用尿激酶供试品进行热原测定。结果注射用胶原酶最小有效稀释浓度为0.04U·mL^-1,当浓度≤60U·mL^-1时对HL60细胞生长无影响,浓度≤6 U·mL^-1时对IL-6和热原测定无影响。注射用尿激酶最小有效稀释浓度为100 U·mL^-1,当浓度≤1 000 U·mL^-1时对HL60细胞生长无影响,浓度≤500U·mL^-1时对IL-6和热原测定无影响。因此,适合HL60-IL6单核细胞活化反应法的注射用胶原酶和尿激酶浓度分别为6,500U·mL^-1。用该方法对供试品进行热原测定,结果均未检出热原。结论 HL60-IL6方法适用于注射用胶原酶和尿激酶热原测定。

量反应平行线测定法在人凝血因子Ⅷ效价测定中的应用

目的建立适用于人凝血因子Ⅷ效价测定(一期法)的统计分析方法。方法采用一期法对人凝血因子Ⅷ的效价进行测定,采用量反应平行线测定法进行效价计算,并对该方法进行方法学验证。采用经验证的方法对来自7家企业的21批人凝血因子Ⅷ样品进行效价测定,并与标准曲线带入法进行比较。结果效价测定范围为标示量的64%~156%;以效价测定值的对数对理论值的对数作线性回归,相关系数r为0.9904;相对偏倚为0.5%~3.1%,其90%置信区间为-3.8%~6.1%;中间精密度为3.8%~6.7%,其95%置信上限为7.0%~12.3%;不同批次的激活的部分凝血活酶(APTT)试剂和人凝血因子Ⅷ缺乏血浆,对测定结果的影响无统计学意义,方法耐用性良好。采用量反应平行线测定法对21批样品进行测定,其结果与标准曲线带入法的结果表现出良好一致性。结论与标准曲线带入法相比,应用量反应平行线测定法分析一期法测定的人凝血因子Ⅷ效价,可增加实验数据的可靠性,并有效控制测定方法的误差,从而更好地控制人凝血因子Ⅷ质量。

《中国药典》聚合酶链式反应法的建立

随着聚合酶链式反应(PCR)在药物质量控制的应用普及,2020年版《中国药典》增订了PCR法通则。该通则规定了采用PCR技术对中药和生化药种属进行鉴别及其他药品质量控制的基本要求,包括对仪器的一般要求、对PCR体系的一般要求、方法适用性试验、测定法(供试品前处理、模板制备、引物、核酸扩增、反应产物检测、结果判定)、附注等。该文介绍了PCR法通则及其起草说明,并对该检测技术在中药、生化药等应用前景进行展望。

胸腺法新原料药及注射剂中聚合物的SEC-HPLC及MALDI-TOF/TOF-MS分析

采用分子排阻色谱(SEC-HPLC)法测定了来自不同企业的10批胸腺法新原料药和28批注射用胸腺法新中的聚合物含量,并采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)法测定了各企业样品中聚合物的相对分子质量。结果显示,38批样品中聚合物含量为0.1%~1.6%,聚合物的相对分子质量为6199,推测聚合物为胸腺法新的二聚体。本试验样品为2018年国家药品抽验评价样品,代表性强,试验方法和试验结果为完善该品种的质量标准提供了参考。

基于多步衍生化的GC-MS法测定胸腺法新中D型氨基酸

建立多步衍生化气相色谱-质谱(GC-MS)测定手性氨基酸的方法,并结合氘代盐酸水解应用于胸腺法新中9种D型氨基酸的含量测定。以异丙醇和三氟乙酸酐为衍生化试剂,对多步衍生化的反应条件、供试品复溶试剂的体积、色谱及质谱条件进行优化,建立胸腺法新中9种氨基酸测定方法,考察灵敏度、线性范围、精密度、准确度和加标回收率等。结果表明,16对D/L型氨基酸和Gly衍生物在29 min内实现基线分离;胸腺法新中的9种氨基酸衍生产物在一定浓度范围内线性关系良好(r2>0.9923);定量限低至0.09~2.79μmol·L-1;精密度实验结果表明RSD<10.90%;对照品准确性实验的平均回收率为76.69%~128.18%;样品平均加标回收率在70.41%~125.39%之间。6批胸腺法新原料药中D-Asp和D-Glu含量较高,分别为0.41%~0.49%和0.25%~0.33%,其他D-氨基酸含量均小于0.25%。本方法高效、准确、专属性好,可同时监控胸腺法新中9种D型氨基酸含量,有望为合成多肽药物全面控制杂质提供新的研究思路。