慢性乙型病毒性肝炎中医证候生物学基础的研究思路

慢性乙型病毒性肝炎(chronic viral hepatitis B,CHB)是危害我国人民健康的重大传染病。鉴于中医对乙肝辨证施治的特色和优势,本文回顾了迄今CHB的证候客观化研究,并针对其存在的问题,从"病-证结合"研究出发,提出了还原论与整体论、控制论与系统论相结合,基于系统生物学的CHB中医证候生物学基础的研究思路、方法和研究途径。

基于偏最小二乘法的中医临床肝炎肝硬化主、次证候分类特征研究

目的:运用偏最小二乘法探讨临床肝炎后肝硬化中医主证候及其兼夹证候的分类特征。方法:规范采集明确诊断的肝炎后肝硬化患者临床症状、体征、舌象、脉象及相关实验室检查等临床表征及生物学信息;采用偏最小二乘法(Partial Leastsquares,PLS)对278例临床资料完整的样本进行证候分类建模(设证候类型为因变量矩阵、相关临床信息为自变量矩阵,采用Leave-One-Out法完成建模),并以之对临床样本进行中医证候分类和预测。结果:278例肝炎后肝硬化临床样本中,有证可辨者共计261例(93.9%)。主证候以瘀热蕴结证(108例)和湿热内蕴证(79例)最多,占71.6%;兼有两个或两个以上的复合证候者215例,占82.38%。其中,主证候为肝郁脾虚证的45例中,兼夹1个次证的29例,包括湿热内蕴证18例,瘀热蕴结证11例。兼夹2个次证的15例,均为瘀热蕴结和湿热内蕴证;主证候为湿热内蕴证的79例中,兼夹1个次证的53例,以兼肝郁脾虚证者为最多(47例,88.7%),其次为瘀热蕴结证。兼夹2个次证的有9例,均为瘀热蕴结和肝郁脾虚证;在主证候为湿热内蕴与肝郁脾虚证的124例病例中,表现为两者复合证候的有76例(62.3%);29例肝肾阴虚主证候中,均兼夹1个次证,均为瘀热蕴结证;同样,108例主证候为瘀热蕴结者中,兼夹1个次证的78例,68例为兼肝肾阴虚证(87.2%)。结论:肝炎肝硬化中医证候复杂,以复合证候为主,且证候相兼出现有一定的规律性。在肝郁脾虚、肝肾阴虚、湿热内蕴及瘀热蕴结4个主证候中,湿热内蕴和肝郁脾虚以及肝肾阴虚和瘀热蕴结组合是最常见的兼夹证候组合,反映了肝炎后肝硬化临床证候多虚实夹杂的特点,也表明中医证候分类具有一定的临床科学基础。

借鉴Delphi法对中医专家舌色诊断经验的拟合研究

目的对中医专家舌色诊断经验进行拟合研究。方法使用标准化舌象采集环境获取临床舌象,借鉴Delphi方法,邀请中医专家对舌色分类和舌色诊断进行4轮咨询,并借助舌色红绿蓝(RGB)分量的比较从侧面进行验证。结果通过4轮的专家咨询,最后将舌色分为淡白、淡红、红、绛、淡紫、紫、青紫和紫红8类;采集的1255幅舌图像中1072幅(87.0%)获得了一致的判别结果;不同舌色的RGB分量差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。结论Delphi法是一种较好的拟合中医专家舌诊经验的方法。

系统生物学——非酒精性脂肪性肝病中医药研究的新途径

系统生物学是系统论与生物学的结合。它包括基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢组学等。利用系统论的思维方法研究生命现象,从多学科、多视角认识中医证候和中医药疗效机制,为中医研究提供了重要的方法学基础和技术条件;系统生物学与中医学系统观和整体观念的核心思想不谋而合。因此,将系统生物学作为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的现代中医药研究平台和支点,必将加速中医药防治NAFLD的现代化研究,也为中医药研究NAFLD提供新思路和新途径。

基于均匀设计的抗肝纤维化中药有效组分配伍研究

目的探索基于中药复方配伍理论的抗肝纤维化有效组分复方的研究方法和意义。方法以抗肝纤维化中药"扶正化瘀胶囊"中4种已知的有效组分或成分(虫草多糖、丹酚酸B盐、苦杏仁甙、绞股蓝总皂甙)为研究对象,分别运用二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)和四氯化碳(CCl_4)诱导的2种大鼠肝纤维化模型,采用均匀设计法"4因子8水平表"分组设计,治疗性给药;以大鼠肝组织胶原含量羟脯氨酸(Hyp)测定为筛选指标,并经均匀设计回归分析获得"最佳配方"。以上述2个不同模型研究获得的各自最佳配方为观察对象,以扶正化瘀胶囊以及四种有效组分合方(最佳配方加被筛除的有效组分)为对照,运用上述2种动物模型,通过观察肝组织Hyp含量和血清ALT活性检测和肝组织纤维化的变化,对所得配方的治疗效果再次进行比较和验证实验。结果(1)DMN模型试验筛选的A配方(虫草多糖60 mg、苦杏仁甙80 mg、绞股蓝总皂甙50 mg)和CCl_4模型试验筛选的B配方(虫草多糖20 mg、苦杏仁甙160 mg、绞股蓝总皂甙50 mg)皆提示由虫草多糖、苦杏仁甙、绞股蓝总皂甙3种有效组分配伍为最佳,但两者量比不同;(2)验证实验显示A配方和B配方均疗效显著,与扶正化瘀胶囊相当(P>0.05),而A配方和B配方添加被筛除的丹酚酸B盐后,显示疗效下降。结论(1)均匀设计在中药有效组分或成分配伍研究中有重要应用价值;(2)基于中药传统复方的有效组分的合理配伍可以达到"重现原复方效应"的目的;(3)有效组分或成分配伍,有内在的量变和质变规律,有"增效"也有"拮抗"现象,不能简单堆砌。

甘草糖提取物对小肠上皮细胞迁移及多胺含量影响的研究

目的:观察甘草糖提取物对小肠上皮细胞(IEC-6)迁移及细胞内多胺(腐胺、精脒和精胺)含量的影响。方法:划痕法造细胞损伤后迁移模型,柱前衍生-高效液相色谱法测定细胞内多胺含量。观察甘草糖复合物对细胞迁移及细胞内多胺含量的影响;观察甘草糖复合物对二氟甲基鸟氨酸(DFMO)致细胞迁移抑制和多胺合成抑制的影响。结果:甘草糖提取物(50、100 mg/L)能促进细胞迁移;可逆转由DFMO所致的细胞迁移抑制;可提高细胞迁移过程中细胞内多胺含量;可逆转由DFMO所致的多胺含量降低。结论:甘草对胃肠黏膜损伤的修复作用可能与其提高细胞多胺含量、促进细胞迁移有关。

脾气虚证患者基因差异表达研究

目的:研究慢性胃炎脾气虚证的特征性基因差异表达谱。方法:慢性胃炎脾气虚证患者及健康志愿者各选4例,镜下取胃黏膜组织,提取总RNA,一一配对制作基因芯片,采用荧光比值、生物信息学、双侧t检验等方法比较分析;实时荧光定量PCR检测相关基因。结果:差异表达基因54条,72.2%下调;其中与营养物质代谢和免疫调节相关差异表达基因45条,71.1%下调;差异基因中有4条基因P<0.05,为显著差异表达基因;实时定量PCR检测差异基因5条,4条与芯片结果一致。结论:慢性胃炎脾气虚证具有特征性的基因差异表达图谱,主要表现为与营养物质代谢及免疫调节相关基因呈下调趋势。

慢性浅表性胃炎脾虚证患者与健康人物质能量代谢基因差异表达研究

目的分析慢性浅表性胃炎脾虚证患者体内脂类、蛋白质、糖类和核酸代谢情况,从物质能量代谢的角度探讨脾虚证的病理发生机制。方法选择4例2004年6月—2005年3月就诊于广州中医药大学一附院和广东省中医院的慢性浅表性胃炎脾虚证患者,选择广州中医药大学健康人4名,钳取患者及健康人胃黏膜进行DNA芯片实验,利用BRB ArrayTools和IPA软件对DNA芯片双通道数据进行数据挖掘和生物信息学分析。结果获得15个与物质能量代谢相关差异基因,占总差异表达基因(20个)的75%,其中上调基因1个,下调基因14个,11个基因为酶基因。其中脂类代谢相关差异基因有ACAA2和CYP20A1,表现为脂肪酸分解和胆固醇转化降低;蛋白质代谢相关差异基因有ALDH9A1、ASL、ASS1、PCYOX1L、RPS28、UBE2D2、UBXN1、B3GNT1、GCNT1和PPP1R3C,表现为影响自主神经、尿素循环等生物学过程的氨基酸代谢降低,蛋白质合成降低,错误折叠蛋白泛素化降解增加,翻译后糖基化和磷酸化修饰降低;糖类代谢相关差异基因有PPP1R3C、B3GNT1和GCNT1,表现为糖原和聚糖合成降低;核酸代谢相关差异基因有RMI1、SMARCD3和PARP1,表现为DNA复制和转录降低,DNA损伤修复增加。结论慢性浅表性胃炎脾虚证患者体内脂类、蛋白质、糖类和核酸代谢水平明显降低,并且主要表现为酶基因表达下调,推测此可能是导致脾虚证营养代谢障碍的重要机制之一。

雷公藤多甙对小鼠生育的影响及肉苁蓉干预作用的研究

目的:研究使用不同时间和剂量的雷公藤多甙(GTW)对昆明小鼠怀孕率的影响及肉苁蓉干预和停用GTW后的自愈倾向。方法:将90只成年雄性昆明鼠随机分为9组(每组10只)。对照组给予1%羧甲基纤维素(CMC)溶液;GTW各组分别给予45.0、30.0、22.5、15.0、7.5mg/(kg·d)GTW混悬液;肉苁蓉各组分别给予30.0、7.5mg/(kg·d)GTW混悬液;停药组给予30.0mg/(kg·d)GTW混悬液。以上各组先灌胃20d,20d后与成年雌鼠1∶2合笼7d。第28d起GTW各组按原剂量继续给药;肉苁蓉各组给原剂量GTW混悬液的同时分别给10.0、2.5g/(kg·d)肉苁蓉煎液;停药组停GTW,改为1%CMC溶液。20d后再次合笼7d。每次合笼后观察雌鼠怀孕率。结果:随着GTW给药时间的延长和剂量的增加,雌鼠怀孕率呈下降趋势。GTW45.0mg/(kg·d)组给药40d后怀孕率降为0%(P<0.01)。肉苁蓉10.0g/(kg·d)组怀孕率由20d时的25%上升到40d时的55%。停药组怀孕率由25%上升到56%,与对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:GTW对雄性小鼠的生殖毒性呈时间和剂量依赖性。肉苁蓉可以改善GTW对雄鼠生殖系统的抑制作用,提高雌鼠的怀孕率。停用GTW20d,怀孕率可以基本恢复正常。

基于受试者工作特征曲线和逐步判别分析法探索实验室指标对慢性乙型肝炎中医证候诊断的价值

目的:探索75个常用临床实验室指标对慢性乙型肝炎中医肝胆湿热、肝郁脾虚证的诊断价值。方法:选取慢性乙型肝炎病人422例,其中肝胆湿热证300例,肝郁脾虚证122例。检测常用实验室指标,包括肝肾功能、凝血功能、乙型肝炎标志物、乙型肝炎病毒DNA定量检测、血常规、激素指标、细胞免疫指标、体液免疫指标、血脂、甲胎蛋白、肝纤维化指标等共75项。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)查看单一指标对慢性乙型肝炎肝胆湿热证、肝郁脾虚证的诊断效率,采用逐步判别分析模型检测差异指标组合对慢性乙型肝炎证候的判别效率。结果:白蛋白、凝血酶原时间、免疫球蛋白A、免疫球蛋白M、尿素氮、血尿酸、嗜碱粒细胞、嗜碱粒细胞百分数、血小板平均体积在慢性乙型肝炎肝胆湿热证与肝郁脾虚证之间存在组间分布差异。上述差异指标的ROC曲线下面积范围为0.42～0.62。对差异指标采用逐步判别分析法建立证候判定模型,其模型自身验证总误判率35.3%,刀切法总误判率为35.3%。结论:无论单一差异指标还是差异指标组合判定模型均未达到较好的判定慢性乙型肝炎中医证候的目的,提示单一采用临床指标判定中医证候具有一定的局限性。

IEC-6细胞迁移药理实验模型建立的研究(英文)

建立适合肠上皮整复研究的IEC-6细胞迁移药理实验模型,并观察黄芪糖复合物对细胞迁移的影响。方法：设立不同的细胞接种密度、划痕后观察时间、辅助材料Matrigel浓度、血清饥饿处理法、细胞迁移抑制剂DF-MO（二氟甲基鸟氨酸）浓度等以考察模型的建立条件,并在已建立的模型上观察受试药的效果。结果：①细胞宜以4×105/mL接种6孔板;②宜划痕后24 h观察细胞迁移数;③5%Matrigel为适宜浓度;④血清饥饿可造成细胞迁移数明显减少,应使用含血清的培养液。⑤DFMO 2.5~5 mmol/L为抑制细胞迁移适宜浓度。⑥黄芪糖复合物及阳性药精脒能促进细胞迁移。结论：建立了适宜药理实验的IEC-6细胞迁移模型,在此模型上可反映受试药对细胞正常迁移及迁移抑制的药效作用。

偏最小二乘法在肝炎后肝硬化中医证候分类建模中的应用

目的:探讨偏最小二乘法(partial least-squares,PLS)在肝炎后肝硬化中医证候分类模型建立中的应用及临床价值。方法:拟定中医四诊等生物信息采集基本要求,用临床流行病学调查方法,采集278例肝炎后肝硬化患者症状、体征、舌象、脉象及临床实验室指标等生物信息;采用逐步回归方法筛选各证候相关指标,设证候类型为因变量矩阵,相关临床信息为自变量矩阵,所有变量均经列最大化处理后导入PLS程序中进行计算,采用留一法(Leave-One-Out,LOO)完成建模和样本的预测。结果:逐步回归建立的5个证候类型回归方程的决定系数R2均在0.7以上;在此基础上,基于PLS建立的肝炎后肝硬化中医证候判识模型对肝郁脾虚、肝肾阴虚、脾肾阳虚、湿热内蕴和瘀热蕴结等主证候的预测准确率分别为73.02%、68.71%、92.45%、84.17%和68.71%。结论:PLS法能提高中医临床生物信息的利用度,在中医复杂证候建模的研究中有一定的推广应用价值。

慢性浅表性胃炎脾虚与脾胃湿热证患者物质能量代谢基因差异表达研究

目的分析慢性浅表性胃炎脾虚证与脾胃湿热证患者体内脂类、蛋白质、核酸、糖类、微量元素和能量代谢情况,从物质能量代谢的角度探讨脾虚证病理发生机制。方法选择2004年6月—2005年3月就诊于广州中医药大学第一附属医院和广东省中医院慢性浅表性胃炎患者8例,其中脾虚证和脾胃湿热证患者各4例,取两组胃黏膜进行DNA芯片实验,利用BRBArrayTools和IPA软件对DNA芯片双通道数据进行数据挖掘和生物信息学分析。结果获得与物质能量代谢相关且表达倍数>2的显著差异表达基因56个,其中上调基因11个,下调基因45个。其中与脂类代谢相关的基因有CRLS1、LRP11、FUT9、GPCPD1、PIGL、SULT1A4、B3GNT1、ST8SIA4和ACADVL,主要涉及脂肪酸、胆固醇、磷脂和糖脂的代谢;与蛋白质代谢相关的基因有ASR-GL1、AARSD1、EBNA1BP2、PUM2、MRPL52、C120RF65、PSMB8、PSME2、UBA7、RNF11、FBXO44、ZFYVE26、CHMP2A、SSR4、SNX4、RAB3B、RABL2A、GOLGA2、KDELR1、PHPT1、ACPP、PTPRF、CRKL、HDAC7、ADPRHL2、B3GNT1、ST8SIA4、DDOST和FUT9,主要涉及到蛋白质的生物合成、蛋白质泛素化、靶向输送和翻译后修饰过程;与核酸代谢相关的基因有DFFB、FLJ35220、TOP2A、SF3A3、CREB3、CRTC2、NR1D2、MED6、GTF2IRD1、C1ORF83、ZNF773和ZMYND11,主要涉及DNA复制与修复,转录调节等;与糖类代谢相关的基因有AGL、B3GNT1、FUT9、ST8SIA4、SULT1A4、DDOST和PIGL,主要涉及糖原的分解和糖复合物的合成;与微量元素代谢相关的基因有COMMD1、SLC39A6、FTL、CHRFAM7A、SCGN和S100A6,主要涉及铜离子、锌离子、铁离子和钙离子代谢;与能量代谢相关的基因有AK3和COX7B,涉及线粒体结构和氧化磷酸化过程。结论脾虚证患者体内脂类、蛋白质、核酸、糖类、微量元素和能量代谢水平明显降低,这可能是导致脾虚证疾病发生的重要机制。

中药有效成分防治脂肪肝的研究进展

中医药防治脂肪肝的研究越来越受到重视。除中药复方研究之外,对脂肪肝防治有效的中药有效组分或成分也在不断探寻中,初步发现了一些能减轻肝脏脂肪沉积的有效成分,兹综述如下。

甘草总黄酮提取纯化工艺研究

目的研究甘草总黄酮提取分离工艺和分析方法。方法比较3种提取方法——超声波提取法、加热回流法和冷浸法对甘草总黄酮提取效果的影响;采用树脂吸附法精制甘草总黄酮并考察不同参数对提取得率和纯度的影响;采用柚皮苷直接扫描法对甘草总黄酮进行分析研究。结果超声波提取法、加热回流法和冷浸法甘草总黄酮提取率分别为5.46%、6.12%和5.04%,以加热回流法提取效果最好。树脂吸附甘草黄酮类成分主要集中在40%～60%乙醇洗脱部位。结论3种方法中以加热回流法提取甘草黄酮效果最好,树脂精制工艺考虑为纯水洗脱树脂后继以80%乙醇洗脱黄酮类成分。

RPS20 miRNA质粒载体的CT26细胞转染条件优化研究

目的探讨阳离子脂质体法转染CT26细胞适宜的转染条件,为小鼠体内以RNA干扰法进行脾虚证相关基因RPS20的功能鉴定提供参考。方法以6孔培养板培养CT26细胞,利用阳离子脂质体转染pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-neg Control plasmid进入CT26细胞,荧光显微镜、流式细胞仪两种方式观察不同剂量的质粒和转染试剂对转染效率的影响。结果荧光显微镜下细胞计数法检测转染效率,4.0μg和6.0μg质粒的转染效率无明显差异;流式细胞仪检测转染效率,以Lipofectamine2000 15.0μL+质粒4μg转染效率最高,平均为25.3%。结论 6孔培养板,4.0μg质粒+15.0 μL Lipofectamine2000为CT26细胞优化的转染条件。

基于脾虚证相关基因功能鉴定的小肠上皮细胞RNA干扰转染条件研究

【目的】探索影响大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)RNA干扰效率的转染条件,为进一步以RNA干扰(RNAi)技术构建不同程度表达靶蛋白的细胞模型打下基础。【方法】以24孔培养板培养IEC-6细胞,利用阳离子脂质体转染FAM-siRNA片段进入IEC-6细胞,采用荧光显微镜和流式细胞仪检测FAM-siRNA和转染试剂Lipofectamine 2000不同剂量比例对转染效率的影响。【结果】(1)采用荧光显微镜检测转染效率,以评分进行秩和检验,结果仅有转染试剂或仅有FAM-siRNA或两者均无的组别评分均为0,转染试剂加FAM-siRNA组别均有或强或弱的荧光表达。(2)采用流式细胞仪检测转染效率,以Lipofectamine 2000 1.0μL+FAM-siRNA 160 nmol/L组转染效率最高(平均76.3%),而空白对照组约为1%。【结论】FAM-siRNA160 nmol/L(20μmol/L、4.8μL,终体积为0.6 mL)+Lipofectamine 2000 1.0μL组合为IEC-6细胞RNA干扰时转染效率最高的转染条件。

二甲肼诱发大鼠大肠癌癌前病变模型的肠道双歧杆菌数量研究

目的:探讨二甲肼(DMH)诱发的大肠癌癌前病变模型大鼠的肠道内双歧杆菌数量与大肠癌癌前病变的关系。方法:应用双歧杆菌属特异性引物实时定量PCR,对实验第3与第9周8只模型组大鼠以及同年龄的7只正常对照组大鼠肠道中的双歧杆菌数量进行检测。结果:第9周的正常对照组大鼠未见明显异常隐窝灶(aberrant crypts foci,ACF),同年龄的模型组平均每只大鼠大肠可形成(37.7±2.6)个ACF。第3周正常对照组与同年龄的模型组大鼠肠道双歧杆菌数量差异无统计学意义,P=0.652;第9周模型组大鼠肠道双歧杆菌数量低于同年龄的正常对照组,但差异无统计学意义,P=0.090。结论:肠道内双歧杆菌的数量与大鼠大肠癌癌前病变没有明显相关性。

健脾活血方对大鼠24h急性酒精中毒的保肝效应及机制研究

目的:研究健脾活血方对大鼠24 h急性酒精中毒的保肝效应及作用机制。方法:28只SD大鼠随机分为正常组(8只)、模型组和健脾活血方组(各10只)。予相应饮用水或健脾活血汤1.0 m L/100 gwt,连续3 d,2次/d。第3天末次给药后,禁食禁水16 h,再次灌胃饮用水或健脾活血汤1.0 m L/100 gwt。1 h后,予等剂量56%乙醇灌胃模型组和健脾活血方组大鼠复制酒精中毒模型。24 h后麻醉,留取血清及肝组织标本,检测相关指标。结果:与模型组比较,健脾活血方组血清ALT活性显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)HE染色见肝细胞胞质内小空泡状改变减轻,库普弗细胞减少,肝组织GSH活性显著升高(P<0.01),肝组织TNOS、i NOS活性显著降低(P<0.05)。结论:健脾活血方通过提高24 h急性酒精中毒大鼠肝脏GSH含量,降低i NOS水平,起到抗氧化应激损伤保护肝脏的作用。

野葛解酒机制的研究进展

对野葛解酒机制近年来的研究进行概括,其研究主要集中在影响酒精吸收代谢、保肝、抗氧化、保护中枢神经系统等方面。