甘草糖提取物对小肠上皮细胞迁移及多胺含量影响的研究

目的:观察甘草糖提取物对小肠上皮细胞(IEC-6)迁移及细胞内多胺(腐胺、精脒和精胺)含量的影响。方法:划痕法造细胞损伤后迁移模型,柱前衍生-高效液相色谱法测定细胞内多胺含量。观察甘草糖复合物对细胞迁移及细胞内多胺含量的影响;观察甘草糖复合物对二氟甲基鸟氨酸(DFMO)致细胞迁移抑制和多胺合成抑制的影响。结果:甘草糖提取物(50、100 mg/L)能促进细胞迁移;可逆转由DFMO所致的细胞迁移抑制;可提高细胞迁移过程中细胞内多胺含量;可逆转由DFMO所致的多胺含量降低。结论:甘草对胃肠黏膜损伤的修复作用可能与其提高细胞多胺含量、促进细胞迁移有关。

慢性浅表性胃炎脾虚证患者与健康人物质能量代谢基因差异表达研究

目的分析慢性浅表性胃炎脾虚证患者体内脂类、蛋白质、糖类和核酸代谢情况,从物质能量代谢的角度探讨脾虚证的病理发生机制。方法选择4例2004年6月—2005年3月就诊于广州中医药大学一附院和广东省中医院的慢性浅表性胃炎脾虚证患者,选择广州中医药大学健康人4名,钳取患者及健康人胃黏膜进行DNA芯片实验,利用BRB ArrayTools和IPA软件对DNA芯片双通道数据进行数据挖掘和生物信息学分析。结果获得15个与物质能量代谢相关差异基因,占总差异表达基因(20个)的75%,其中上调基因1个,下调基因14个,11个基因为酶基因。其中脂类代谢相关差异基因有ACAA2和CYP20A1,表现为脂肪酸分解和胆固醇转化降低;蛋白质代谢相关差异基因有ALDH9A1、ASL、ASS1、PCYOX1L、RPS28、UBE2D2、UBXN1、B3GNT1、GCNT1和PPP1R3C,表现为影响自主神经、尿素循环等生物学过程的氨基酸代谢降低,蛋白质合成降低,错误折叠蛋白泛素化降解增加,翻译后糖基化和磷酸化修饰降低;糖类代谢相关差异基因有PPP1R3C、B3GNT1和GCNT1,表现为糖原和聚糖合成降低;核酸代谢相关差异基因有RMI1、SMARCD3和PARP1,表现为DNA复制和转录降低,DNA损伤修复增加。结论慢性浅表性胃炎脾虚证患者体内脂类、蛋白质、糖类和核酸代谢水平明显降低,并且主要表现为酶基因表达下调,推测此可能是导致脾虚证营养代谢障碍的重要机制之一。

脾气虚证患者基因差异表达研究

目的:研究慢性胃炎脾气虚证的特征性基因差异表达谱。方法:慢性胃炎脾气虚证患者及健康志愿者各选4例,镜下取胃黏膜组织,提取总RNA,一一配对制作基因芯片,采用荧光比值、生物信息学、双侧t检验等方法比较分析;实时荧光定量PCR检测相关基因。结果:差异表达基因54条,72.2%下调;其中与营养物质代谢和免疫调节相关差异表达基因45条,71.1%下调;差异基因中有4条基因P<0.05,为显著差异表达基因;实时定量PCR检测差异基因5条,4条与芯片结果一致。结论:慢性胃炎脾气虚证具有特征性的基因差异表达图谱,主要表现为与营养物质代谢及免疫调节相关基因呈下调趋势。

IEC-6细胞迁移药理实验模型建立的研究(英文)

建立适合肠上皮整复研究的IEC-6细胞迁移药理实验模型,并观察黄芪糖复合物对细胞迁移的影响。方法：设立不同的细胞接种密度、划痕后观察时间、辅助材料Matrigel浓度、血清饥饿处理法、细胞迁移抑制剂DF-MO（二氟甲基鸟氨酸）浓度等以考察模型的建立条件,并在已建立的模型上观察受试药的效果。结果：①细胞宜以4×105/mL接种6孔板;②宜划痕后24 h观察细胞迁移数;③5%Matrigel为适宜浓度;④血清饥饿可造成细胞迁移数明显减少,应使用含血清的培养液。⑤DFMO 2.5~5 mmol/L为抑制细胞迁移适宜浓度。⑥黄芪糖复合物及阳性药精脒能促进细胞迁移。结论：建立了适宜药理实验的IEC-6细胞迁移模型,在此模型上可反映受试药对细胞正常迁移及迁移抑制的药效作用。

甘草总黄酮提取纯化工艺研究

目的研究甘草总黄酮提取分离工艺和分析方法。方法比较3种提取方法——超声波提取法、加热回流法和冷浸法对甘草总黄酮提取效果的影响;采用树脂吸附法精制甘草总黄酮并考察不同参数对提取得率和纯度的影响;采用柚皮苷直接扫描法对甘草总黄酮进行分析研究。结果超声波提取法、加热回流法和冷浸法甘草总黄酮提取率分别为5.46%、6.12%和5.04%,以加热回流法提取效果最好。树脂吸附甘草黄酮类成分主要集中在40%～60%乙醇洗脱部位。结论3种方法中以加热回流法提取甘草黄酮效果最好,树脂精制工艺考虑为纯水洗脱树脂后继以80%乙醇洗脱黄酮类成分。

RPS20 miRNA质粒载体的CT26细胞转染条件优化研究

目的探讨阳离子脂质体法转染CT26细胞适宜的转染条件,为小鼠体内以RNA干扰法进行脾虚证相关基因RPS20的功能鉴定提供参考。方法以6孔培养板培养CT26细胞,利用阳离子脂质体转染pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-neg Control plasmid进入CT26细胞,荧光显微镜、流式细胞仪两种方式观察不同剂量的质粒和转染试剂对转染效率的影响。结果荧光显微镜下细胞计数法检测转染效率,4.0μg和6.0μg质粒的转染效率无明显差异;流式细胞仪检测转染效率,以Lipofectamine2000 15.0μL+质粒4μg转染效率最高,平均为25.3%。结论 6孔培养板,4.0μg质粒+15.0 μL Lipofectamine2000为CT26细胞优化的转染条件。

基于脾虚证相关基因功能鉴定的小肠上皮细胞RNA干扰转染条件研究

【目的】探索影响大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)RNA干扰效率的转染条件,为进一步以RNA干扰(RNAi)技术构建不同程度表达靶蛋白的细胞模型打下基础。【方法】以24孔培养板培养IEC-6细胞,利用阳离子脂质体转染FAM-siRNA片段进入IEC-6细胞,采用荧光显微镜和流式细胞仪检测FAM-siRNA和转染试剂Lipofectamine 2000不同剂量比例对转染效率的影响。【结果】(1)采用荧光显微镜检测转染效率,以评分进行秩和检验,结果仅有转染试剂或仅有FAM-siRNA或两者均无的组别评分均为0,转染试剂加FAM-siRNA组别均有或强或弱的荧光表达。(2)采用流式细胞仪检测转染效率,以Lipofectamine 2000 1.0μL+FAM-siRNA 160 nmol/L组转染效率最高(平均76.3%),而空白对照组约为1%。【结论】FAM-siRNA160 nmol/L(20μmol/L、4.8μL,终体积为0.6 mL)+Lipofectamine 2000 1.0μL组合为IEC-6细胞RNA干扰时转染效率最高的转染条件。

溃疡性结肠炎脾胃虚实证候核糖体蛋白基因表达研究

目的研究健康人、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)脾虚证和湿热证患者核糖体蛋白(ribo-somal protein,RP)基因表达差异情况,为从蛋白合成角度理解"脾为气血生化之源"提供实验依据。方法制作RP基因芯片,对4名健康人、4例UC脾虚证和4例UC湿热证患者结肠黏膜进行检测,应用BRB-TOOL(3.9)软件包进行数据分析,对差异基因进行生物信息学分析。结果成功制作了包括77条RP基因,2条RP类似基因(RPL26-like1、RPL7-like1)的低密度芯片。UC(脾虚证+湿热证)患者与健康人之间有12条差异基因,全部为下调基因;湿热证与健康人之间有19条差异基因,全部呈下调趋势;脾虚证与健康人有3条差异表达基因,全部为下调基因;脾虚证与湿热证有6条差异表达基因,全部为上调基因。聚类分析显示健康人与UC患者样品可以根据本芯片的基因表达谱进行分类,湿热证和脾虚证可以通过聚类分开。多个差异基因有共同转录调节因子。结论成功制作了RP基因芯片,UC脾虚证和湿热证RP基因表达下调;健康人、UC脾虚证和UC湿热证都有各自相应的RP基因表达谱。

脾虚证唾液淀粉酶活性改变及其机制的研究进展

历代医家认为脾与唾液有着密切关系,唾液淀粉酶(sAA)已被国内外学者作为反映脾虚证唾液蛋白分泌改变的主要指标进行脾虚证的本质研究;研究发现脾虚证患者在酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值下降,并对其发生机制进行探讨,认为主要与副交感神经功能偏亢、交感神经系统——NO通路功能障碍、总唾液糖蛋白及唾液淀粉酶N-糖基化均不完全等有关。今后可结合现代医学理论,从神经、内分泌调节、唾液蛋白的翻译后修饰环节改变、信号转导、蛋白质组学和基因组学方向进一步深入研究揭示脾虚证唾液淀粉酶活性改变具体的发生机制。

白术糖复合物提取纯化工艺研究

目的：研究白术糖复合物提取纯化方法。方法：水提法提取白术糖复合物，中性氧化铝、树脂吸附法进行精制纯化，考察不同方法的除杂效果，确定工艺参数；盐酸紫外分光光度法、蒸发光散射法检测提取物中的糖含量。结果：白术提取液经中性氧化铝精制后糖复合物得率与纯度分别为23％～25．5％和56％～60％；根据D900弱碱性阴离子交换树脂、D201阴离子交换树脂、AB-8大孔吸附树脂的静态脱色曲线，它们对白术提取液色素杂质的交换能力大小为D900〉AB-8〉D201；D900离子交换树脂吸附法精制白术糖复合物得率为17％以上，盐酸紫外分光光度法检测糖纯度在76％以上。结论：水提后D900离子交换树脂吸附法精制白术糖复合物效果较好，糖定量分析以盐酸紫外分光光度法较为理想。

脾阳虚大鼠模型建立及理中汤疗效观察

目的建立适用于中医"证"研究及中药药理学研究的脾阳虚大鼠模型。方法给予大鼠每日游泳、隔日注射利血平、隔日灌胃番泻叶3周,以建立脾阳虚模型,第4周～第6周灌胃温阳健脾方药理中汤,以其治疗结果验证造模效果。结果造模期间模型大鼠出现活动减少、嗜卧、畏冷蜷缩、便溏,毛色枯槁不荣等脾阳虚症状,与正常大鼠相比,体温、体重、摄食量、尿D-木糖排泄率等均有显著性差异,但病理切片未发现明显差异;6周后理中汤组与正常组比较各指标差异无显著性,但自然恢复组与正常组比较差异有显著性。结论利血平合劳倦过度/寒凉泄下法建立的脾阳虚大鼠模型一般症状和生化指标都与脾阳虚患者临床表现基本相符,用此法建立的脾阳虚大鼠模型可为脾阳虚"证"本质研究及相关方药研究提供参考。

白术糖复合物对IEC-6细胞分化及绒毛蛋白表达的影响

目的:观察白术糖复合物对小肠隐窝细胞(IEC-6)细胞分化及分化标志物之一绒毛蛋白(villin)表达的影响。方法:IEC-6细胞分为空白对照组、阳性对照药胃泌素组(250μg/L)、白术糖复合物组(62.5、125、250、500、1000 mg/L),经相应处理后。光镜下观察细胞大体形态;透射电镜下观察细胞超微结构;RT-PCR法检测villin mRNA表达;免疫荧光法检测villin蛋白表达。结果:①给药7 d,光镜下空白对照组细胞处于幼稚状态;胃泌素和白术糖复合物组细胞处于分化状态;②给药20 d,电镜下空白对照组胞核较大,常染色质比例较高,细胞边缘仅见少量微绒毛;胃泌素和白术糖复合物组胞核较小,常/异染色质比例协调,细胞边缘生成大量微绒毛;③给药6 h,空白对照组细胞villin mRNA表达非常少,胃泌素组和白术糖复合物组villin mRNA表达均明显高于空白对照组;④给药7 d,免疫荧光检测发现空白对照组细胞仅有很少villin蛋白表达;胃泌素组表达非常强烈;白术糖复合物组表达稍弱于胃泌素组,但有特异性绒毛蛋白聚集点。结论:白术糖复合物有通过上调IEC-6细胞绒毛蛋白表达及分布而促其分化的作用。

白术和黄芪不同提取部位对小肠上皮细胞增殖的影响

目的观察白术和黄芪的不同提取部位对小肠上皮细胞(IEC-6)增殖的影响。方法以系统溶剂分离法分别提取白术和黄芪的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、醇沉上清液和多糖部位;另将白术和黄芪以乙醇提取,D101大孔树脂吸附法得到40%和70%乙醇洗脱部位。MTT法检测白术和黄芪正丁醇部位、醇沉上清液、多糖部位、40%和70%醇洗脱液对IEC-6细胞增殖的作用。结果初步发现黄芪正丁醇部位、醇沉上清部位、糖复合物、40%和70%醇洗脱部位加药24h能促进细胞增殖;白术40%乙醇洗脱液部位加药24h能促进细胞增殖,白术正丁醇部位、糖复合物、40%和70%乙醇洗脱液部位加药48h能促进细胞增殖。结论白术和黄芪正丁醇部位、多糖部位、40%和70%醇洗脱液在加药后不同时间对IEC-6细胞有不同程度的促进增殖作用;采用系统溶剂分离法和大孔树脂吸附法提取白术和黄芪不同部位,可以用于细胞增殖实验,为进一步开展白术和黄芪在细胞水平上的药理研究提供参考。

慢性胃炎脾气虚证与脾胃湿热证的差异表达基因比较

目的:比较慢性胃炎脾气虚证与脾胃湿热证患者差异表达基因。方法:分别提取慢性胃炎脾气虚和脾胃湿热患者胃黏膜组织RNA各4例,逆转录荧光探针标记后杂交制作BiostarH-140 s基因芯片。采用荧光值ratio、生物信息学、t检验等方法分析结果,实时荧光定量PCR检测部分相关基因。结果:获得差异表达基因245条,主要为营养物质消化吸收运输、物质能量合成代谢、细胞周期增殖分化、免疫反应等相关基因;有显著意义的差异表达基因77条;实时定量PCR检测10条基因,6条与芯片结果一致。结论:慢性胃炎脾气虚和脾胃湿热2个证型基因表达存在明显差异,提示中医的临床辨证分型与基因差异表达有一定关系。

利血平对大鼠唾液蛋白分泌的影响

目的:观察利血平对大鼠唾液蛋白分泌的影响.方法:实验大鼠随机分为2组,实验组皮下注射利血平0.4mg/(kg·d),正常组皮下注射等量生理盐水.10d后,抽取唾液检测酸刺激前后唾液淀粉酶活性(sAA)比值;HE染色检测腮腺形态学和透射电镜计数腮腺酶原颗粒;ELISA法检测血管活性肠肽(VIP)和环磷酸腺苷(cAMP)含量.结果:实验组较正常组摄食量明显减少,体质量下降;sAA活性比值显著低于正常组(0.39±0.18vs0.80±0.21,P<0.01);HE染色未见2组腮腺有明显病理改变,透射电镜发现实验组腮腺单位观察视野内酶原颗粒数量明显高于正常组(41.4±4.9vs34.6±5.2,P<0.01);实验组血清VIP含量明显低于正常组(22.5±13.1μg/Lvs38.5±14.1μg/L,P<0.05),2组腮腺VIP含量无明显差异;实验组血清cAMP明显高于正常组(125.8±15.5nmol/Lvs105.3±16.7nmol/L,P<0.05);2组腮腺cAMP水平无明显差异.结论:利血平导致大鼠消化代谢机能下降,在酸刺激下大鼠的唾液蛋白分泌明显减少,可能是通过降低血清VIP水平调节唾液蛋白分泌.

脾阳虚大鼠肽转运载体蛋白表达及转运功能的改变

目的观察脾阳虚模型大鼠小肠黏膜肽转运载体1(PepT1)的表达及其转运功能的变化。方法采用劳倦泄下合利血平复合因素造模法建立脾阳虚大鼠模型,RP-HPLC法测定cefalexin血药浓度以评价小肠黏膜PepT1的转运吸收功能,免疫组化方法观察脾阳虚大鼠肠上皮PepT1蛋白表达情况。结果十二指肠给药120min后,RP-HPLC法测定模型大鼠血清cefalexin浓度为(5.23±2.10)μg/ml,高于正常对照组的(2.52±0.47)μg/ml(P<0.01);模型大鼠小肠黏膜上PepT1蛋白表达较正常对照大鼠表达升高。结论脾阳虚证模型大鼠小肠黏膜肽转运载体PepT1表达及对cefalexin的转运能力增强。

幽门螺杆菌vacA和cagA基因全长分子系统发育分析

文章从GenBank中下载所有含有vacA和cagA基因的H.pylori菌株的VacA和CagA全长氨基酸序列,利用ClastalX 2.0和MEGA 5.05软件构建VacA和CagA分子系统发育树,探讨两基因之间的分子系统发育关系和不同聚类群的临床感染结果与基因型特征。结果显示,VacA和CagA具有高度相似的分子系统发育树,并且所有H.pylori菌株在系统发育树中具有相同的分布特点,分别聚类为东亚株群1、2和西方株群3个聚类群。其中东亚株群1患萎缩性胃炎比例较高,vacA基因型以s1c/m1b和s1a/m1b为主,cagA基因型以EPIYA-ABD为主;东亚株群2患十二指肠溃疡的比例较高,vacA基因型以s1c/m2和s1a/m2为主,cagA基因型以EPIYA-AB'C为主;西方株群患十二指肠溃疡和胃炎的比例相当,萎缩性胃炎比例较低,vacA基因型以s1a/m1a和s1b/m1a为主,cagA基因型以EPIYA-AB/B'CC为主。这些结果说明,vacA和cagA基因可能具有共进化的遗传关系;东亚株群1、2和西方株群分别具有不同的vacA和cagA基因亚型,这可能与其临床感染结果密切相关,因此,在进行H.pylori相关性疾病分析时,有必要结合vacA和cagA基因型的亚型做深入分析。

胃乃安新制剂对水浸束缚应激性胃溃疡的药效作用

目的:观察胃乃安新制剂对水浸束缚应激性胃溃疡的作用及其作用机制。方法:在应激性胃溃疡模型下,从肉眼观察、病理切片、透射电镜三个层面评价胃乃安新制剂对水浸束缚应激性胃溃疡的药效,并检测胃组织的丙二醛、超氧化物歧化酶水平以探讨胃乃安可能的作用机制。结果:与模型组比较,肉眼观察及病理切片评分结果表明,高剂量组、雷尼替丁组均有抗应激性胃溃疡效果(P<0.01),且新制剂抗溃疡效果呈剂量依赖性关系;透射电镜观察结果表明新制剂可明显逆转主细胞、壁细胞的超微结构损伤性改变;新制剂可降低胃组织MDA含量,升高SOD活性。结论:胃乃安新制剂对水浸束缚应激性胃溃疡有显著抗损伤作用,其机理可能与抗氧化,清除自由基有关。

肝癌并发上消化道出血的危险舌象分析

目的:以望舌为主了解原发性肝癌并发上消化道出血的危险因素,为临床预防提供依据。方法:收集737例原发性肝癌患者的临床资料,并使用标准化舌象采集环境获取其临床舌象,由医学专家给出舌象诊断,使用条件Logistic回归对肝癌并发上消化道出血的危险因素进行筛选。结果:舌色按由淡白、淡红到红进行分类,结果显示上消化道出血的主要危险因素主要与肝癌临床分期(OR=3.607,P=0.000)、舌形异常(OR=3.295,P=0.005)、舌下脉形状(OR=1.558,P=0.008)和血清总胆红素水平(OR=1.008,P=0.015)有关;而舌色按紫与不紫进行分类,结果显示舌色也与肝癌并发上消化道出血密切相关(OR=1.989,P=0.047)。结论:舌体胖大、舌下脉增粗或迂曲、舌色见紫、肝癌临床分期进展和血清胆红素水平过高均为上消化道出血的危险因素,以舌象观察为主可望作为一种预测肝癌并发上消化道出血的简捷方法。

黄芪和白术提取物对IEC-6细胞迁移的影响

目的筛选益气健脾中药黄芪和白术促进小肠上皮细胞(IEC-6)迁移的有效提取部位。方法以系统溶剂分离法从黄芪、白术药材分别得到糖复合物、正丁醇萃取物、醇沉上清液以及大孔树脂吸附后70%乙醇洗脱部位作受试药。IEC-6细胞接种于6孔板并培养24 h,划痕法造细胞迁移模型,划痕后加入各受试药,24 h后观察细胞迁移情况;并进一步观察具有促进细胞迁移的有效部位对二氟甲基鸟氨酸(DFMO)所致细胞迁移抑制的影响。结果 50 mg.L-1的黄芪糖复合物或白术糖复合物能促进细胞迁移(P<0.01);黄芪、白术的正丁醇萃取物、醇沉上清液、大孔树脂吸附后醇洗脱部位对细胞迁移均无明显影响;2.5 mmol.L-1的DFMO能抑制细胞迁移(P<0.01),加入DFMO同时加入100 mg.L-1黄芪糖复合物或200 mg.L-1白术糖复合物能使细胞迁移恢复至接近正常水平。结论黄芪糖复合物和白术糖复合物能促进IEC-6细胞迁移,还能使DFMO所致的细胞迁移抑制恢复至接近正常水平。