运用微电极技术测定三角帆蚌外套膜Ca^(2＋)流量的研究

Ca既是珍珠和贝壳中的主要组成成分（CaCO3占95%以上）,又是普遍存在的细胞内第二信使,在生物体内承担着非常重要生理功能。生物矿化的研究表明外套膜细胞在珍珠和贝壳生长中起着非常重要的作用[1,2],并且Ca^2＋在外套膜中也保持一个较高的水平^[3]。研究贝类Ca代谢，特别是外套膜组织的Ca^2＋跨膜转运，对进一步阐明贝壳以及珍珠形成机理，提高优质珠的产量都有着重要意义。

日本沼虾微卫星引物筛选及群体遗传多样性分析

采用(CT)15、(CA)15两种生物素标记及磁珠富集法构建了太湖日本沼虾基因组微卫星富集文库。120个微卫星克隆中83个位点的核心序列重复在10个以上,长度介于191～580bp,平均为311bp;重复类型中,(CA/GT)n及(AG/TC)n分别占59.09%及20.45%,还检测到(GC)n、(AAG)n、(ACAA)n和(GGCAGA)n等17种类型,包括25.75%完美型、20.45%非完美型和53.80%复合性。用其中12条微卫星引物扩增吴江、滨湖、宜兴和吴兴4个群体240个个体的基因组DNA,各位点表现出较高的遗传多样性,除Mni86、Mni103和Mni114外,其它群体位点大都表现出显著的杂合子缺失,4个群体的遗传分化为低度分化(FST<0.05),4个群体中97.58%遗传变异存在于群体内,仅有2.42%的遗传变异来自于群体之间;吴江和吴兴群体亲缘关系最近,与宜兴和滨湖群体亲缘关系渐远。

三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1483bp,由长92bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),257bp的3′非翻译区,和1134bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为41.9ku,理论等电点为5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178,Ser305,Ser321,Pro325,Val331,Pro346等6个氨基酸残基具有特异性,此外还发现3个特殊的氨基酸残基位点以及2个软体动物特有的氨基酸残基。三角帆蚌β-actin氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达98%～99%。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。RT-PCR显示β-actin基因在外套膜、血液、肝、肾、胃、肠、鳃、斧足共8个组织的表达基本一致,具有良好的稳定性。

缢蛏ScHsc70 cDNA的分子特性和表达分析

从缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)cDNA文库中筛选出一条热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)同源序列,采用EST扩增和5′RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增方法获得全长cDNA序列,共2 335 bp,包括76 bp的5′非翻译区和309 bp的3′非翻译区,以及1 950 bp的开放阅读框。阅读框共编码649个氨基酸,推算的分子量约为70.89 kD,理论等电点为5.28。氨基酸序列分析结果表明,该基因的氨基酸序列含有HSP70家族的3个签名序列,2个糖基化位点,1个ATP-GTP结合位点,且C末端具有GGXP四肽重复序列以及细胞质特异性调控基序EEVD。该基因是组成型HSC70(Heat shock cognate 70)亚家族基因成员,被命名为ScHsc70。基于氨基酸序列的双壳贝类聚类分析表明,缢蛏与南极帽贝(Laternula elliptica)、文蛤(Meretrix meretrix)的亲缘关系最近。荧光定量表达分析显示,ScHsc70 mRNA在缢蛏水管、鳃、斧足、外套膜、肝和性腺等组织中以不同水平存在,其中在外套膜中的表达量最低,而在水管和肝中的表达量最高。经副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和副鳗弧菌(V.anguillarum)诱导后,ScHsc70 mRNA在缢蛏肝中的水平呈现先升高后下降的变化趋势,且分别在感染后的第20小时和第30小时达到最高。结果提示,缢蛏ScHsc70基因可能参与了对细菌感染的防御反应。

三角帆蚌钙网蛋白基因cDNA的分子特征与表达分析

为研究淡水珍珠形成相关基因及调控机理,以三角帆蚌为研究对象,借助cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了三角帆蚌的钙网蛋白基因(calreticulin,HcCRT)cDNA序列,该序列长1 437 bp,包含231 bp的5'非编码区(untranslated region,UTR)和615 bp 3'UTR以及591 bp的开放阅读框(ORF),共编码196个氨基酸残基,包含一段由21个氨基酸组成的信号肽和一段由175个氨基酸的成熟肽,分子量约为22.4 ku,理论等电点5.01。氨基酸序列分析表明,该序列不存在跨膜结构,疏水性分析显示该蛋白整体为亲水性蛋白。氨基酸列比对分析显示,HcCRT具有保守的钙网蛋白家族结构,具有2个保守的钙网蛋白家族标签序列:KHEQNIDCGGGYLKVF和IMFGPDICG,与其他已知物种的CRT具有较高保守性,其中与斑马鱼的相似度为77%,与长牡蛎和马氏珠母贝的相似度为70%。对三角帆蚌HcCRT蛋白序列的二级结构和三级结构进行预测分析,显示该蛋白同时含螺旋和折叠。实时荧光定量PCR分析结果显示,HcCRT在外套膜、血液、鳃、斧足、肝脏、肾脏、肠和闭壳肌等8个组织中均有表达,其中在外套膜中表达量最高,血液次之,在其他组织的表达量极少。初步推测HcCRT参与了三角帆蚌珍珠形成的生物矿化过程。

草鱼C1qC基因的克隆及表达分析

为了研究C1qC基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)免疫过程中所起的作用,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得了C1qC基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆的C1qC cDNA全长为916 bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)735 bp,5′端非编码区(untranslated region,UTR)89 bp和3′端非编码区(UTR)92 bp。735 bp的ORF共编码244个氨基酸,相对分子量为26 162.5 U。同源性分析表明,草鱼与斑马鱼(Danio rerio)的相似度最高,达到71%。经草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)诱导后,草鱼C1qC基因在鳃、皮肤、肌肉、肝、中肾、心脏、头肾等组织中的mRNA表达水平均显著上调。在草鱼胚胎发育的各个阶段都能检测到C1qC mRNA的表达,说明该基因可能在草鱼胚胎和鱼苗的免疫反应和早期发育中起重要作用。本研究将为今后在草鱼免疫功能方面深入研究C1qC基因提供基础资料。