产灵菌红素沙雷氏菌的诱变育种

通过紫外线—氯化锂复合处理灵菌红素生产菌沙雷氏菌 (Serratiasp )W 0 2 0 6,用高浓度葡萄糖为碳源的选择性平板定向筛选抗葡萄糖分解代谢物阻遏的高产株 ,筛得高产突变株B 2 0 ,相对于原始菌株 ,B 2 0摇瓶发酵灵菌红素产量提高了 3倍 ,5L反应器上的产量提高了 63 %。

胶原蛋白的高效制备及与明胶的鉴别

在分析酸提取法和酶解法提取牛皮中胶原蛋白各自的优缺点后,研究并最终确定了一种提取牛皮中胶原蛋白的新方法——酸酶复合法,该法工艺简单,在相对较短的制备时间内,胶原蛋白的提取率可以达到54.5%,同时又保证了胶原蛋白的天然三螺旋结构。同时以对胶原蛋白性质的研究结果为基础,建立一种快速且准确的胶原蛋白和明胶的鉴定及质量评价方法——快速鉴定评价法,包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、丹宁酸沉淀实验、胰蛋白酶敏感性实验和体外成纤维能力实验。酸酶复合法和快速鉴定评价法对胶原蛋白提取工艺的大规模生产应用及对市场上各种产品的鉴定及品质评价具有实际意义。

高密度发酵制备重组人可溶性TRAIL

目的 :利用原核重组表达技术 ,完成人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL ,又称凋亡素 2配体 ,Apo- 2 L )的中试。方法 :可溶性 TRAIL编码基因插入改建的 p BV 2 2 0载体 ;在发酵过程中 ,控制溶解氧在 30 %～ 5 0 % ,30℃生长 6 h,4 2℃诱导培养 4 h;菌体上清行金属亲和层析。结果 :发酵液中最终菌体密度 D(6 0 0 )达 8.0 (相当于每升发酵液含 15 g湿菌体 ) ,TRAIL占菌体总蛋白的 4 0 %左右 ,含量超过 0 .6 g/ L。其中 ,所表达的 TRAIL 2 0 %～ 30 %在上清而直接有活性 ,70 %～ 80 %呈包涵体。上清用亲和层析一步使其纯度达 70 %以上 ;包涵体超声破菌后经两次洗涤 ,纯度达到 80 %以上。 结论 :TRAIL

可溶性TRAIL蛋白的高密度培养及补料策略研究

采用分批补料的方法高密度培养重组大肠杆菌C6 0 0 pBV TRAIL制备人可溶性TRAIL蛋白 ,优化发酵工艺 ,探索简单高效的分离纯化方法并测定蛋白生物活性。通过比较几种不同的补料策略 :间歇流加、DO stat、pH stat,摸索了一种流加策略 ,即DO stat pH stat组合流加 ,有效的避免了发酵过程中 ,尤其是诱导表达阶段乙酸积累的增加 ,使TRAIL蛋白在高密度培养条件下 ,得到高效表达。菌体密度最终达到 30 0g L(WCW )以上 ,可溶性TRAIL蛋白占菌体总蛋白的 4 2 % ,含量为 1 1g L。在整个发酵过程中 ,乙酸浓度接近于 0 ,且未使用任何特殊手段 ,如纯氧、加压等 ,简化了发酵工艺 ,降低了发酵成本 ,为TRAIL的工业化生产创造了条件。

TRAIL蛋白的体外活性稳定性初步研究

大肠杆菌发酵表达的TRAIL蛋白经过两步纯化可得到纯度95%以上的活性蛋白,得率为40%。天然TRAIL蛋白为同源三聚体形式,在三聚体中心隐蔽结合Zn^(2+),Zn^(2+)可维持TRAIL蛋白天然结构的稳定性。研究发现在纯化后的重组可溶性TRAIL蛋白中添加Zn^(2+),并且Zn^(2+)与TRAIL单体的摩尔比例达到2:1时,TRAIL蛋白的活性达到最高。本文初步研究了TRAIL蛋白的体外活性稳定性问题,发现在添加了最适Zn^(2+)后的TRAIL蛋白保存溶液中添加25mmol/L LArg与50mmol/L L-Glu有助于抑制TRAIL蛋白活性下降、并可能长期稳定蛋白活性。

TRAIL包涵体在细胞内重折叠现象的初步研究

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Apo2L/TRAIL)是一种新型的抗肿瘤蛋白。但在大肠杆菌表达系统中,表达的TRAIL蛋白往往容易聚集形成包涵体。本文对重组TRAIL包涵体在胞内重折叠转化成可溶性TRAIL蛋白作了初步探索,结果表明:当蛋白表达后,迅速降低温度至30℃并添加50μg/mL氯霉素继续培养4 h,可溶性TRAIL产量可提高至16.7%。这一结果在3.7L罐上也得到了证实,可溶性TRAIL表达量达到14.5%。

提高重组TRAIL表达产率的优化策略

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Apo2L/TRAIL)是一种新型的抗肿瘤蛋白。针对缩短发酵周期,提高生产效率这一目标,首先在摇瓶中利用响应面设计优化发酵表达条件,总TRAIL蛋白的表达量提高到25.7%。在此基础上研究了发酵条件对可溶性TRAIL蛋白表达量的影响。于3.7L发酵罐放大进行补料-分批发酵实验时,单位菌体可溶性TRAIL蛋白的表达量提高了67%,实现了在大肠杆菌高密度培养过程中单位细胞重组TRAIL蛋白的可溶性表达和体积生产率的提高。