利用CRISPR/Cas9基因编辑技术探究团头鲂mdh基因功能

苹果酸脱氢酶基因(mdh)与肌肉的生长密切相关,可以通过影响骨骼肌的能量代谢来调节肌纤维的生长及类型转化,为探索mdh基因在团头鲂中的功能及作用,实验利用CRISPR/Cas9技术对团头鲂mdh进行敲除,并对敲除突变体的表型及基因表达变化进行了研究。结果显示,CRISPR/Cas9可成功应用于团头鲂mdh基因的敲除,与对照组相比,敲除突变体个体大小明显小于对照组,生长性状数据显示,其体重、体长均发生显著变化。qPCR结果显示,敲除突变体中mdh的表达水平显著低于对照组,同时,在敲除突变体中,生肌决定因子及肌纤维类型因子基因MyoG、 MyHCⅡa的表达水平随着mdh表达水平的下降显著降低,而MyHCⅡb的表达未发生显著变化。研究表明,CRISPR/Cas9可用于团头鲂基因的高效、快速编辑,也证明mdh基因敲除后可能会抑制团头鲂的生长,在团头鲂的生长过程中起着促进作用。这一研究结果为团头鲂的生长性状研究提供了一定的理论基础,有利于mdh基因在团头鲂分子育种中的合理应用。

团头鲂选育家系亲子鉴定方法的建立

研究旨在建立一套准确、经济的团头鲂(Megalobrama amblycephala)家系鉴定体系,以期为团头鲂的遗传参数评估及基因组和分子标记育种奠定基础。精选8个高多态性的微卫星标记对二段法筛选后的228尾耐低氧快生长团头鲂“浦江2号”子代进行亲子鉴定分析,利用CERVUS软件分析实验结果。等位基因频率分析结果显示8个微卫星标记的平均等位基因数(N_(a))为8个,平均观测杂合度(H_(o))为0.813,平均期望杂合度(H_(e))为0.775,平均多态信息含量(PIC)为0.743。亲子鉴定结果显示双亲性别已知时8个微卫星标记的累积排除概率为0.9999,说明筛选出的8个微卫星标记适用于团头鲂家系的亲子鉴定分析。当使用筛选的8个微卫星标记进行亲子鉴定时,228尾团头鲂子代中有221尾子代能找到其父母本,实际鉴定率为96.93%,这与实际记录的系谱信息一致。研究成功地为筛选后的耐低氧团头鲂个体找到父母本并划分家系,为进一步开展遗传参数的评估工作奠定了基础。

团头鲂(♀)×翘嘴鲌(♂)杂交三倍体的生长性能及形态分析

鲂鲌(Megalobrama amblycephala♀×Culter alburnus♂)三倍体因性腺不发育或败育而将更多能量用于生长,因为不育可以保持F1代的杂种优势而避免继续繁殖造成的种质衰退,同时具备生态安全性,因此,鲂鲌三倍体具有优越的“生长优势”或“经济性状”。为了解鲂鲌三倍体的生长情况与形态特征,本研究运用静水压技术对团头鲂(♀)×翘嘴鲌(♂)杂交受精卵进行三倍体化诱导,获得了诱导成功的鲂鲌三倍体群体(hybrid-3n)与未诱导成功的鲂鲌二倍体群体(hybrid-2n),并构建团头鲂(MA)和翘嘴鲌(CA)2个自交群体,通过生长对比实验比较分析了4个群体鱼的生长性能及形态差异。结果显示,在210 d生长周期内,鲂鲌三倍体绝对增重率[(0.88±0.11)g/d]比二倍体提高8.64%,较MA提高20.55%,较CA提高120.00%。可数性状上,鲂鲌三倍体和二倍体杂种指数平均值分别为41.05和36.07,都略偏向于母本团头鲂。可量性状上,鲂鲌三倍体杂种指数平均值为36.73,略偏向于母本团头鲂;鲂鲌二倍体杂种指数平均值为57.57,略偏向于父本翘嘴鲌。聚类分析显示,鲂鲌三倍体首先和二倍体聚在一起归为一类,然后再与母本团头鲂聚为一支,最后再与父本翘嘴鲌聚在一起。判别分析显示,对鲂鲌三倍体的判别准确率为90%,对4个群体的综合判别率达95%。主成分分析共得到累计贡献率达75.10%的4个主成分,主要体现了鱼体高和躯干的形态变异。综合分析表明,鲂鲌三倍体具有较快的生长速度,具备在生产上推广应用的基础条件;鲂鲌三倍体与二倍体体型均介于双亲之间,都略偏向于母本,主要体现了鱼体高和躯干的形态变异。研究结果对鲂鲌杂交后代种群鉴定、倍性育种具有重要意义。

团头鲂三倍体的微卫星遗传特征及生长性能分析

为研究团头鲂三倍体育种,对团头鲂三倍体和二倍体2个群体进行微卫星遗传结构特征分析和生长性能比较。利用筛选得到的20个微卫星标记对团头鲂三倍体和二倍体进行遗传多样性分析。试验结果表明,团头鲂三倍体、二倍体的平均等位基因数分别为2.75、3.05,平均期望杂合度分别为0.5061、0.5412,平均多态信息含量分别为0.4249、0.4378。团头鲂2种倍性群体的大多数位点均表现为偏离哈迪—温伯格平衡,多数位点的遗传偏离指数显示杂合子过量。筛选出2个群体特异性标记TTF1和Mam-EST110,可区分二倍体和三倍体2个群体。同时通过2个群体的生长对比试验,对团头鲂三倍体的生长性能进行评价。试验结果显示,团头鲂三倍体相对于二倍体出现了等位基因缺失、杂合度下降的现象。此外,三倍体与二倍体在1龄阶段生长速度无显著差异(P>0.05),而在2龄阶段三倍体的平均体质量和绝对质量增加率均显著高于二倍体(P<0.05),表现出明显的生长优势。研究结果对团头鲂三倍体遗传结构研究、倍性鉴定以及三倍体育种工作的进一步开展具有参考意义。

低氧胁迫对鱼类影响的研究进展

溶解氧作为水环境中重要的环境因子,是鱼类健康生存的基础。适宜的溶解氧水平能够促进鱼类的生长,对鱼类的繁殖、捕食和运动等产生积极的影响[1]。低氧胁迫不仅严重制约了鱼类的生长发育,而且会引起鱼类产生应激反应,导致代谢紊乱,严重时导致鱼体死亡[2]。而经长期演化,鱼类已进化出一系列机制来应对低氧。低氧环境中,鱼类可以通过各种生理反应来抵抗溶解氧的不足,如降低机体能量的消耗、增强氧吸收的能力等,从而应对低氧胁迫[3]。

溶解氧对团头鲂耐低氧新品系F5代的鳃组织形态及各组织酶活性的影响

为研究不同浓度溶解氧(DO)对团头鲂(Megalobrama amblycephala)耐低氧新品系F5代鳃组织形态以及各组织酶活性的影响,本研究将团头鲂在低氧[DO为(1.7±0.2)mg/L]和高氧[DO为(19.3±0.5)mg/L]条件下分别处理0、4和7 d,恢复常氧[DO为(7.8±0.3)mg/L]7 d后,通过石蜡切片观察鳃组织的形态,并测定了鳃、肝胰腺、肠道、肌肉中过氧化氢酶(CAT)、琥珀酸脱氢酶(SDH)及乳酸脱氢酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量。石蜡切片结果显示,随着低氧处理时间的延长,团头鲂新品系鳃丝的层间细胞团体积减小,鳃小片表面积增加,恢复常氧7 d后又有所恢复。高氧条件下,层间细胞团体积增大,鳃小片表面积减小,恢复常氧7 d后也会恢复。酶活性检测结果显示,在低氧和高氧2种条件下,随着处理时间的延长,CAT活性和MDA含量在各组织中的变化无明显规律,但均有显著差异(P<0.05)。低氧条件下,LDH活性显著增高,SDH活性显著降低(P<0.05)。高氧条件下,LDH活性显著降低,SDH活性显著增高(P<0.05)。本研究可为溶解氧对团头鲂的鳃组织以及各组织酶活性的影响提供基础资料,并为团头鲂新品系的养殖与选育奠定基础。

低氧对鲂鲌杂交种F_(3)鳃结构及生理生化的影响

向常氧[溶解氧质量浓度(7.19±0.23)mg/L]水中充入氮气或空气对鲂鲌杂交种(团头鲂♀×翘嘴鲌♂)F_(3)进行低氧[溶解氧质量浓度(1.04±0.12)mg/L]及复氧[溶解氧质量浓度(7.16±0.20)mg/L]处理,取常氧、低氧12 h、低氧24 h、低氧72 h及复氧24 h的鲂鲌杂交种F_(3)鳃组织,并利用苏木精-伊红染色、阿利新蓝-过碘酸染色、抗氧化酶活性测定、荧光定量PCR等技术,探究鲂鲌杂交种F_(3)鳃组织对低氧的适应性。试验结果显示:低氧处理72 h后,鲂鲌杂交种F_(3)的鳃组织层间细胞团宽度和鳃小片长度分别为(42.42±4.76)μm、(109.09±8.96)μm,鳃组织与水的接触面积较常氧显著增加;低氧胁迫显著降低了鲂鲌杂交种F_(3)鳃组织黏液细胞的密度,鳃组织分泌黏液减少;低氧胁迫下,鲂鲌杂交种F_(3)鳃组织的超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量在处理72 h时最大,过氧化氢酶的活性在处理24 h时活性最大;低氧胁迫显著改变了鳃组织中caspase-3、Bcl-2的mRNA表达水平,但趋势各有不同,在低氧处理72 h组,caspase-3的mRNA表达量最大而Bcl-2的mRNA表达量最小;复氧处理24 h,鳃组织的各项生理生化水平指标及结构形态均有所恢复。综上,低氧环境会显著影响鲂鲌杂交种F_(3)鳃组织的形态结构、黏液分泌功能和抗氧化酶活性,但并未完全破坏其自我调节能力。

黑麦草与配合饲料对鲂鲌杂交种生长、消化及鱼肉品质的影响

为比较鲂鲌杂交种(团头鲂♀×翘嘴鲌♂)在摄食黑麦草与配合饲料后生长、消化性能、鱼肉品质的差异,挑选鲂鲌杂交种幼鱼分别用黑麦草和配合饲料投喂30 d后,分析其生长、肌肉营养成分、消化酶活性、消化道结构及鱼肉品质等。试验结果显示:(1)黑麦草组鱼的生长指标显著低于配合饲料组,但肠体指数、比肠长显著高于配合饲料组(P<0.05)。(2)黑麦草组鱼肉的水分含量较高,粗脂肪、粗蛋白、粗灰分含量均低于配合饲料组(P<0.05),并且黑麦草组的肌纤维面积也小于配合饲料组。(3)黑麦草组肠道胰蛋白酶、脂肪酶活性相比配合饲料组低,但淀粉酶活性较高;配合饲料组鱼的肝胰腺脂肪堆积、肠道褶皱杯状细胞增多。(4)电子舌分析显示,主成分分析图中两者的二维截距大小为黑麦草组>配合饲料组。(5)核苷酸分析表明,黑麦草组的5′-腺苷一磷酸(甜)、5′-肌苷一磷酸(鲜)含量均高于配合饲料组,而次黄嘌呤(苦)含量相对较少。综上,黑麦草和配合饲料对鲂鲌杂交种生长消化及鱼肉滋味影响较大,摄食高蛋白配合饲料的鱼体生长更快,而摄食黑麦草的鱼肌肉滋味更佳,肠道内消化酶活性会根据摄食饵料的不同而产生相应的变化。

草鱼感染GCRV后血液中淋巴细胞变化及BCL10表达分析

为了研究草鱼BCL10基因在草鱼出血病中的应答机制,文章克隆了BCL10基因,并利用生物信息学、荧光定量和血涂片等技术对其进行了分析。生物信息学结果显示,BCL10基因开放阅读框为738 bp,编码245个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示,感染病毒后草鱼体内BCL10表达量持续上调,在肝胰腺和中肾中第4天达到峰值,第7天表达量开始下调。血涂片显微镜观察发现了血液中淋巴细胞在感染病毒后第1到第4天下降,第7天时上升。肾脏的组织病理学观察也发现中肾中肾小管上皮细胞第1到第7天逐渐空泡化,脱落坏死。以上结果表明,BCL10基因参与了草鱼应对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)入侵的免疫应答。

饥饿胁迫对团头鲂鳃组织结构及Na^+/K^+-ATP酶、抗氧化酶的影响

为了研究不同饥饿时间(0、5、10、15、20、25和30d)对团头鲂耐低氧F4幼鱼鳃组织的影响,在温度(25±1.0)℃、溶解氧(7.0±0.5)mg/L条件下,以体质量为(30.5±2.6)g的团头鲂耐低氧F4幼鱼为研究对象,利用组织切片、扫描电镜技术和分光光度计法研究饥饿胁迫对其鳃组织结构、Na^+/K^+-ATP酶和抗氧化酶的影响。酶活性结果显示:随着饥饿时间的延长,团头鲂耐低氧F4鳃组织的Na^+/K^+-ATP、SOD和CAT酶活性逐渐降低(P<0.05),恢复投喂7d后基本恢复到正常水平。形态学观察显示:随着饥饿时间延长,团头鲂耐低氧F4鳃小片平均伸出长度增加(P<0.05),层间基质的厚度减小(P<0.05),这种变化导致鳃小片呼吸面积增加和层间基质体积减小(P<0.05)。恢复投喂7d后,基本恢复到正常投喂时的形态。由此可见,在饥饿胁迫情况下,团头鲂耐低氧F4幼鱼抗氧化系统受到严重干扰,鱼体主动调整鳃小片呼吸面积适应饥饿胁迫。