海洋无脊椎动物补体系统研究进展

补体系统是先天免疫的重要组成部分,在免疫反应中发挥重要作用。补体的研究可以为海洋无脊椎动物提供病害防治的理论基础。本文介绍了海洋无脊椎动物补体系统中已报道的C1q、MBL、ficolin、MASP、B因子、C3和C6等成分,比较了海洋无脊椎动物补体成分的功能,描述了其补体激活途径和补体系统进化情况。目前,海洋无脊椎动物补体的研究发展很快,揭示可能存在与脊椎动物差异较大的补体系统,但是缺乏系统的基础研究而未能构建起理论模型。

配合饲料替代杂鱼对中华绒螯蟹生长发育、体成分及脂肪酸组成的影响

通过分别投喂配合饲料和天然杂鱼,研究配合饲料替代杂鱼对中华绒螯蟹生长发育、体成分及脂肪酸组成的影响。试验池塘设在上海市崇明县水产技术推广站特色水产养殖基地,每种饵料设3个平行。试验时间为2010年4月至11月,养殖结束后统计各试验组的存活率、体质量、产量,并随机取样测定各试验组雌雄蟹的肝胰腺指数、性腺指数、出肉率,同时测定肝胰腺、性腺和肌肉中水分、总脂、粗蛋白含量及脂肪酸组成。结果显示,杂鱼组和配合饲料组蟹的存活率、体质量、肝胰腺指数、性腺指数、出肉率等指标均无显著差异(P>0.05);杂鱼组雌雄蟹肝胰腺及雄蟹肌肉中水分含量极显著高于配合饲料组(P<0.01);杂鱼组雌雄蟹肝胰腺、性腺及雌蟹肌肉中总脂含量均显著低于配合饲料组(P<0.05);杂鱼组雌雄蟹肝胰腺中粗蛋白含量均显著高于配合饲料组(P<0.05),但杂鱼组雌蟹卵巢中粗蛋白含量极显著低于配合饲料组(P<0.01)。配合饲料组雌蟹肝胰腺游离脂肪酸含量显著高于杂鱼组(P<0.05),磷脂含量杂鱼组显著高于配合饲料组(P<0.05);配合饲料组雌蟹卵巢和肌肉甘油三酯含量均显著高于杂鱼组(P<0.05或P<0.01),游离脂肪酸和磷脂含量则杂鱼组显著高于配合饲料组(P<0.05或P<0.01);雌蟹肌肉中胆固醇含量配合饲料组极显著高于杂鱼组(P<0.01)。两组饵料雄蟹肝胰腺各脂类组成无显著差异;精巢中甘油三酯及游离脂肪酸含量为杂鱼组显著高于配合饲料组(P<0.01),磷脂含量为杂鱼组显著低于配合饲料组(P<0.05);雄蟹肌肉胆固醇含量配合饲料组显著低于杂鱼组(P<0.05)。杂鱼组雄蟹肝胰腺和肌肉中LOA含量极显著或显著低于配合饲料组(P<0.01或P<0.05),而杂鱼组雄蟹肌肉中ARA含量显著高于配合饲料组(P<0.05);杂鱼组雌蟹卵巢中LNA、ARA和DHA的含量极显著或显著低于配合饲料组(P<0.01或P<0.05)。研究结果表明,适宜的配合饲料替代杂鱼全程养殖中华绒螯蟹成蟹对其生长发育无显著负面影响,而对其体成分组成及脂肪酸组成有一定影响。

以配合饲料替代杂鱼对中华绒螯蟹生长及消化酶活性的影响

用塑料围网将一个池塘分隔成6个100 m2的小池塘,每池放养100只体质量为(10.01±1.02)g的中华绒螯蟹Eriocheir sinensis,分别投喂配合饲料和杂鱼,每种饲料设3个重复。养殖180 d后随机采样,称量体质量,测量壳长和壳宽,计算肝胰腺指数、性腺指数、出肉率、肌肉营养成分和消化道消化酶活性。结果表明:投喂两种饲料的中华绒螯蟹的体质量、肝胰腺指数、性腺指数、出肉率、壳长、壳宽及肌肉中的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量均无显著性差异(P>0.05),说明以配合饲料替代杂鱼对中华绒螯蟹的生长无明显影响;配合饲料组蟹胃的类胰蛋白酶和肠的脂肪酶活性显著高于杂鱼组(P<0.05),杂鱼组蟹肠的淀粉酶活性显著高于配合饲料组(P<0.05),两种饲料对蟹消化道其他各部位消化酶的活性均无显著性影响(P>0.05)。

植酸酶对斑点叉尾鮰脊椎形态和非特异性免疫相关酶活力的影响

在全植物基础饲料中添加不同水平的植酸酶,研究植酸酶对斑点叉尾鮰脊椎形态和非特异性免疫功能的影响.设6个等氮(37.50%粗蛋白)等能(17.00kJ/g总能)的实验组,分别是阴性对照(negative control,NC)组:在基础饲料中添加1%无机磷(CaHPO4);阳性对照(positive control,PC)组:NC组再添加1%无机磷(CaHPO4);4个植酸酶组:NC组中添加4种不同水平的植酸酶(250,500,1 000,2 000U/kg).每组设5个平行,对斑点叉尾鮰[(5.78±0.07)g/尾]进行为期60d的饲喂实验.结果表明:与NC组相比,添加植酸酶组增质量率显著提高(P<0.05),饲料系数显著降低(P<0.05);当植酸酶添加水平为1 000U/kg时,增质量率显著高于PC组(P<0.05)并达到最大值117.42%;植酸酶组鱼体蛋白保留率显著高于NC组(P<0.05),而与PC组差异无统计学意义(P>0.05);随着植酸酶添加水平的提高,鱼体磷保留率显著提高(P<0.05);在NC组中,明显发现鱼体脊椎中部出现弯曲和侧凸现象;当植酸酶添加水平为500U/kg时,肝溶菌酶(lysozyme,LSZ)活力显著高于NC组(P<0.05),而2 000U/kg植酸酶组头肾LSZ活力显著高于其他各组(P<0.05);当植酸酶添加水平大于1000U/kg时,头肾LSZ活力显著高于PC组(P<0.05);PC组肝超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力显著高于其他组(P<0.05);当植酸酶添加水平为500 U/kg时,肝碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)的活力与PC组无显著差异(P>0.05).综上所述,植酸酶的最适添加水平为1 000U/kg,在全植物饲料中添加植酸酶能促进斑点叉尾鮰的生长和鱼体蛋白保留,并能预防脊椎畸形和提高鱼体非特异性免疫相关酶活力.

醋酸棉酚对异育银鲫生长性能、血清生化指标和棉酚残留的影响

本试验旨在研究醋酸棉酚对异育银鲫生长性能、血清生化指标和棉酚残留的影响。选取平均体重为(31.68±0.01)g的异育银鲫270尾,随机分为3组(每组3个重复,每个重复30尾),分别饲喂在基础饲料中添加0(对照组)、300和900 mg/kg醋酸棉酚的试验饲料。试验期为8周。结果表明:随着醋酸棉酚添加量的增加,异育银鲫的生长性能呈现降低趋势。与对照组相比,添加300 mg/kg醋酸棉酚组增重率降低了8.43%(P<0.05),特定生长率降低了5.82%(P<0.05),饲料系数升高了7.69%(P>0.05);添加900 mg/kg醋酸棉酚组增重率降低了12.22%(P<0.05),特定生长率降低了7.94%(P<0.05),饲料系数升高了14.69%(P<0.05)。随着醋酸棉酚添加量的增加,异育银鲫的肥满度和内脏指数逐渐降低,而肝胰指数则逐渐升高,其中添加900 mg/kg醋酸棉酚组的肥满度和肝胰指数与对照组相比差异显著(P<0.05)。醋酸棉酚添加量对异育银鲫的体长体高比以及肌肉水分、灰分、粗蛋白质和粗脂肪含量未产生显著影响(P>0.05)。添加900 mg/kg醋酸棉酚组异育银鲫的血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性和肌酐含量显著高于对照组(P<0.05),而血清碱性磷酸酶活性和总蛋白含量则显著低于对照组(P<0.05)。各组异育银鲫的血清尿素、总胆固醇、甘油三酯、总胆红素、葡萄糖和钙含量无显著差异(P>0.05)。随着醋酸棉酚添加量的增加,异育银鲫的肌肉和肝脏游离棉酚含量显著增加(P<0.05)。由此得出,当饲料中醋酸棉酚添加量达300 mg/kg时,异育银鲫的生长性能降低,组织中棉酚残留量增加;当饲料中醋酸棉酚添加量达900 mg/kg时,异育银鲫的肝功能和肾功能还会受到损伤。

育成规格和饵料对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)雄蟹可食部分营养成分的影响

本实验通过投喂不同饵料后,研究不同育成规格中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)雄蟹肝胰腺、性腺和肌肉等可食部分含量、营养成分及脂类组成的变化。肌肉营养成分测定表明:育成规格对粗脂肪、甘油三酯和磷脂含量有一定影响(P>0.05或P<0.05);饵料对水分、粗蛋白、游离脂肪酸、胆固醇和磷脂含量没有显著影响(P>0.05)。肝胰腺营养成分测定表明:育成规格对粗脂肪、胆固醇和磷脂含量有一定影响(P>0.05或P<0.05);饵料对水分、粗蛋白、甘油三酯和游离脂肪酸的含量没有显著影响(P>0.05)。性腺营养成分测定表明:育成规格对粗脂肪、粗蛋白、游离脂肪酸、甘油三酯和胆固醇含量有一定影响(P>0.05或P<0.05);饵料对水分、粗蛋白和磷脂含量没有显著影响(P>0.05),杂鱼组三种规格粗脂肪和甘油三酯含量显著高于配合饲料组(P<0.05)。总体试验结果表明:育成规格以及饵料对中华绒螯蟹雄蟹可食部分含量和营养成分含量有一定影响。

饲料中添加溶菌酶对草鱼生长性能和抗感染能力的影响

在基础饲料中分别添加溶菌酶制品0(对照)、100、200、300、400和500mg/kg,每组设置5个重复,饲喂草鱼(6.93±0.27g)60d,旨在根据草鱼的生长性能和抗感染能力评价溶菌酶的添加效果,并确定其适宜用量。结果表明,饲料中添加溶菌酶对草鱼生长性能和抗感染能力有显著影响。试验前45d,试验组的草鱼特定生长率显著低于对照组;60d时,100～300mg/kg组的草鱼特定生长率与对照组差异不显著,400mg/kg组和500mg/kg组显著低于对照组。各试验组草鱼的饲料系数随饲料中溶菌酶含量的增加呈现先降低再升高的趋势,200mg/kg组饲料系数最低。通过腹腔注射的方法对草鱼进行嗜水气单胞菌攻毒,结果表明,200～500mg/kg组的草鱼死亡率显著低于对照组和100mg/kg组。饲用溶菌酶对草鱼内源免疫酶活性和内源消化酶活性有一定的刺激作用。抑菌试验结果表明,该溶菌酶制品对常见革兰氏阴性菌有明显的抑菌作用。综合草鱼的生长性能和抗感染能力,认为该试验条件下溶菌酶制品在草鱼饲料中的适宜添加量为200～300mg/kg。

蟹寄江氏伪钟虫Pseudovorticella jiangi防治药物的筛选

采用静水生物毒性试验法,研究8种药物对蟹寄江氏伪钟虫(Pseudovorticella jiangi)的杀灭效果,并探讨苯扎溴铵对中华绒螯蟹大眼幼体和Ⅰ期仔蟹的急性毒性。结果显示,各药物对江氏伪钟虫24 h LC50依次为:结晶紫0.18 mg/L,苯扎溴铵0.26mg/L,高锰酸钾1.53 mg/L,月苄三甲氯铵1.81 mg/L,硫酸锌2.31 mg/L,亚甲基蓝3.53 mg/L,磺胺甲氧嘧啶钠5.96 mg/L,甲醛23.04mg/L。苯扎溴铵对江氏伪钟虫2 h LC50为6.57 mg/L;对大眼幼体2、12、24、48、72、96 h LC50分别为54.78、14.81、5.5、3.64、2.78、2.94mg/L,安全浓度为0.48 mg/L;对Ⅰ期仔蟹12、24、48、72、96 h LC50分别为21.46、14.7、7.78、5.44、4.02 mg/L,安全浓度为0.65 mg/L。依据安全性、高效性、经济性和方便性为渔药选择原则,苯扎溴铵最适合作为河蟹养殖生产中江氏伪钟虫的防治药物,建议大眼幼体和Ⅰ期仔蟹阶段采用泼洒浓度为0.35 mg/L进行防治,大眼幼体阶段也可采用药浴浓度为8.0 mg/L、时间为2 h的药浴法进行防治。

亚东鲑线粒体COⅠ与COⅡ基因遗传多样性分析

[目的]分析亚东鲑线粒体COⅠ与COⅡ基因遗传多样性。[方法]分别从西藏亚东河与亚东鲑养殖站采集野生与养殖亚东鲑各15尾样品,对其线粒体DNA COⅠ、COⅡ基因全序列进行PCR扩增、测序比对。[结果]序列长度分别为631、634 bp。序列分析结果显示:30条亚东鲑线粒体DNA COⅠ、COⅡ序列分别检测到1种、3种单倍型,均无碱基插入、缺失,COⅡ序列有2个位点出现碱基替换;COⅠ、COⅡ序列T、C、A和G碱基平均含量分别为29.5%、28.97%,30.6%、28.47%,22.5%、27.03%和17.4%、15.53%,其中A+T的含量(52.0%、56.0%)均显著高于G+C含量(48.0%、44.0%),均表现出明显的碱基偏倚;COⅠ、COⅡ单倍型多态性(h)与核苷酸多态性(π)值分别为0、0.80与0、0.000 1;根据Kimura双参数模型构建基于线粒体COⅠ、COⅡ序列的系统进化树,两亚东鲑鱼遗传距离分别为0、0.002 4。[结论]西藏亚东鲑的遗传多样性水平较低,且养殖和野生群体无遗传分化。

不同尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼亲本群体的遗传特征分析

从86对尼罗罗非鱼遗传图谱标记中筛出17对种间差异性微卫星引物,分别对杂交亲本尼罗罗非鱼苏丹群体、新吉富群体,奥利亚罗非鱼以色列群体、茂名群体的遗传特征进行分析。结果表明,4个罗非鱼群体有效等位基因数:新吉富(2.8)>苏丹(2.72),以色列(2.96)>茂名(2.6);遗传杂合度:苏丹(0.73)>新吉富(0.68),以色列(0.89)>茂名(0.56);多态性含量:苏丹(0.58)>新吉富(0.51),以色列(0.56)>茂名(0.52),尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼分别以新吉富、茂名群体遗传多样性较低。尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼群体间平均遗传距离为0.3057,尼罗罗非鱼苏丹群体与新吉富群体间的遗传距离为0.107,奥利亚罗非鱼以色列群体与茂名群体间的遗传距离为0.1268,尼罗罗非鱼苏丹群体与奥利亚罗非鱼茂名群体间的遗传距离最大。

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)延伸因子EF-2基因全长cDNA克隆及表达

采用RT-PCR和RACE方法克隆了中华绒螯蟹延伸因子EF-2全长cDNA,序列分析表明EF-2全长2752bp,编码846个氨基酸。经BLASTX分析表明,EF-2核苷酸序列与镶边拟蠢蟹EF-2序列的同源性最高,其相似性为88%;所编码的氨基酸序列与甲壳动物EF-2的氨基酸序列相似性都在90%以上。聚类分析显示,中华绒螯蟹EF-2的氨基酸序列与镶边拟蠢蟹EF-2聚为一支,并与其它甲壳动物聚为一体。荧光定量PCR结果显示,EF-2在正常成熟中华绒螯蟹肌肉中表达量最高,精巢、肝胰腺中有少量表达,心脏、卵巢、胃、肠、鳃中有微量表达。检测了不同发育状态的幼蟹、早熟蟹和正常成熟蟹EF-2在肝胰腺、鳃以及肌肉中的相对表达情况;同时也检测了在不同pH处理下幼蟹EF-2在肝胰腺和鳃中随时间变化的相对表达情况,结果显示pH胁迫对幼蟹EF-2表达有一定的诱导效果。

斑马鱼下颌损伤后的再生组织的超微结构观察及神经递质分析

斑马鱼(Danio rerio)具有很强的再生能力是生物再生研究的良好模型,尤其是下颌组织和尾鳍有复杂的组织学结构。本文结合形态观察检测递质类化合物的动态变化。斑马鱼下颌组织被切除掉约1/3后,2小时创面细胞收缩,神经递质类化合物的释放增加。在修复的第2天创面形成较完整的表皮组织,递质类物质如多巴胺(DA)、γ-氨基丁酸(GABA)谷氨酸(Glu)以及甘氨酸(Gly)等的含量达到峰值。到5天的时候下颌被剪除部位外部形态已经大部分恢复,且递质类化合物的含量呈现高位维持或缓慢下降。结果提示神经递质在斑马鱼下颌再生过程中发挥重要作用。

不同脂肪源饲料对中华绒螯蟹幼蟹生长、消化酶活力和脂肪酸组成的影响

选用初始体重为(2.15±0.10)g的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)雄性幼蟹,随机分为5组(每组12只幼蟹),饲喂100%鱼油组(简称F1组)、100%豆油组(F2组)、100%亚麻油组(F3组)、50%鱼油+50%豆油组(F4组)、50%鱼油+50%亚麻油组(F5组)不同脂肪源配制的5种等氮等能饲料。实验蟹单个体养殖,实验周期为112 d。结果表明,F5组体重、增重率和特定生长率都显著高于其他饲料组(P<0.05),各组的蜕壳间隔和肝胰腺指数没有显著差异(P>0.05)。肝胰腺组织消化酶活力测定结果表明,F1组幼蟹肝胰腺的类胰蛋白酶活力显著高于其他各组(P<0.05);F3组的胃蛋白酶活力显著高于其他各组(P<0.05);F1组、F2组和F4组的脂肪酶活力显著高于其他两组(P<0.05);各组的淀粉酶活力差异不显著(P>0.05)。脂肪酸测定结果表明,肝胰腺和肌肉中的亚油酸(LOA)(C18:2n-6)、亚麻酸(LNA)(C18:3n-3)、EPA(C20:5n-3)和DHA(C22:6n-3)等主要脂肪酸含量与饲料脂肪酸组成呈正相关关系,F1组的高度不饱和脂肪酸(HUFA)含量显著高于其余各组(P<0.05),F2组的LOA含量显著高于其余各组(P<0.05),F3组的LNA含量显著高于其余各组(P<0.05)。本研究结果表明,以50%的豆油或亚麻油替代鱼油能促进中华绒螯蟹幼蟹的生长,但可能使幼蟹的成活率降低。以豆油或亚麻油替代鱼油会影响幼蟹胰蛋白酶、胃蛋白酶和脂肪酶的活力和肝胰腺、肌肉脂肪酸组成。

应用于miRNA靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定

以牙鲆空通气孔同源框2基因(empty spiracles homeobox 2,emx2)为例,构建包含emx2 3'UTR区的野生型和突变型双荧光素酶重组报告表达载体,以期应用于mi RNA靶标的检测。利用Trizol法提取牙鲆成鱼精卵巢混合组织总RNA,参照已克隆出来的emx2基因c DNA序列,设计并合成emx2 3'UTR片段的引物并进行PCR扩增,将得到的基因片段和psi CHECK-2载体双酶切后,用T4 DNA Ligase酶进行连接反应,并转化入DH5α感受态细胞,筛选后得到野生型重组质粒;同时采用定点诱变法对emx2基因进行体外定点诱变并采用同样的方法形成突变型重组质粒。对野生型和突变型重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。成功克隆了emx2 3'UTR区,并将emx2 3'UTR区的mi RNA靶点序列GACTTGA突变为AGTCCAG,成功构建了野生型和突变型包含emx2 3'UTR区的mi RNA靶标检测载体。通过RT-PCR、基因重组及定点诱变技术成功构建了应用于mi RNA靶标验证的野生型和突变型双荧光素酶报告载体psi CHECK-emx2-3'UTR和psi CHECK-mutated-emx2-3'UTR。

不同Ca2＋养殖条件下三角帆蚌外套膜和内脏团组织细胞的钙含量及其对碳酸酐酶的影响

为了探讨三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)在不同钙离子浓度养殖时,内脏团和外套膜细胞对环境中钙离子的吸收,以及细胞内钙离子浓度对碳酸酐酶的影响,本实验设定了5种钙离子的环境浓度(0 m M、0.5m M、1.25 m M、2 m M、3 m M),采用流式细胞仪测定内脏团和外套膜组织细胞内钙离子含量,用荧光定量PCR检测α-碳酸酐酶基因(HcCA)表达,并用乙酸对硝基苯酯的水解间接测定碳酸酐酶活性,以期能阐明环境中钙浓度对组织细胞钙含量的影响,和组织细胞内不同钙含量与碳酸酐酶基因表达和酶活性之间的关系。研究结果表明,在相同环境的钙离子浓度下,活体三角帆蚌的内脏团细胞中钙含量显著高于外套膜细胞(P<0.05),并且表明从0 m M到2 m M浓度,内脏团和外套膜细胞内的钙含量显著上升(P<0.05),在3 m M浓度时出现下降(P<0.05)。同时,细胞内Ca^(2+)含量较低时,HcCA在内脏团和外套膜中的表达量均显著低于细胞内Ca^(2+)含量较高组(P<0.05),但细胞内Ca^(2+)荧光强度为8×104时达到饱和且开始下降,而HcCA的表达在细胞内Ca^(2+)荧光强度为6×104已经最高,并开始下降。环境钙离子浓度在0 m M、0.5 m M时碳酸酐酶活性显著高于1.25 m M、2 m M、3 m M浓度组(P<0.05),而且1.25 m M、2 m M、3 m M浓度组间无显著差异(P>0.05),由此发现碳酸酐酶在0.5 m M钙离子浓度中活性较高但表达量却较低,而在1.25 m M和2 m M浓度中表达量高但活性较低,并且碳酸酐酶外套膜细胞酶活性在各浓度均显著高于内脏团细胞(P<0.05)。本研究为三角帆蚌水体最适养殖钙浓度提供了重要依据。

牙鲆dazl基因的克隆与表达分析

dazl(deleted in azoospermia-like)基因是多种物种精子发生的重要调控因子,为探讨该基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺发育分化中的作用,本研究采用同源克隆和RACE技术克隆了牙鲆dazl基因的cDNA序列,利用生物信息学方法分析了其序列结构,并利用实时荧光定量PCR技术检测了该基因在牙鲆成体组织和早期发育阶段的表达情况。结果发现:牙鲆dazl cDNA序列全长2 031 bp,包括105 bp的5'端非翻译区,1 275 bp的3'端非翻译区和编码217个氨基酸残基的651 bp开放阅读框;氨基酸同源序列比对显示该序列存在一个高度保守的RRM(RNA recognition motif)结构域,且该结构域在鱼类中具有100%的序列一致性;荧光定量PCR结果显示dazl基因主要在牙鲆性腺中表达,且在精巢中的表达高于卵巢;在牙鲆早期发育阶段,dazl基因在未受精卵、受精卵及囊胚期均有较高的转录本,而在原肠胚期表达开始降低,至孵化后3 d一直保持较低的水平,这些丰富表达的母源性dazl mRNA可能参与了胚胎发育中原始生殖细胞的形成。本研究为进一步阐明dazl基因在牙鲆生殖发育中的功能奠定了基础。

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)Perlucin蛋白原核表达条件的优化及表达产物的鉴定

采用PCR方法从三角帆蚌外套膜cDNA中扩增perlucin基因的开放阅读框,连接到pET-28a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白pET-28a-Hcperlucin。通过优化培养温度、IPTG浓度以及诱导时间,得出重组融合蛋白的最佳表达条件分别为:37℃、0.1 mmol/L IPTG、6 h。重组融合蛋白主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,表达重组融合蛋白的相对分子量与预测值相符,约为21 kD,并能与鼠抗His-tag单克隆抗体进行特异性结合,表明重组融合蛋白构建成功。

牙鲆kiss2基因的分子鉴定及表达分析

为克隆与牙鲆生殖相关的神经内分泌因子kiss2基因,并检测该基因在牙鲆成体不同组织及早期不同发育阶段的表达变化,本研究采用Trizol法提取牙鲆成鱼各组织及早期不同发育阶段样品总RNA;参照其他物种的kiss2 c DNA序列,设计并合成kiss2引物进行PCR扩增;运用实时荧光定量PCR检测kiss2基因在牙鲆成鱼各组织及早期不同发育阶段的表达情况。结果成功地获得长度为449 bp的牙鲆kiss2 c DNA序列,其中编码区序列为366 bp,编码121个氨基酸。在该序列中发现了高度保守的"FNYNPLTLRF"序列,此序列可以调节促性腺激素释放激素和黄体生成素的合成与释放。定量PCR结果显示,牙鲆kiss2基因在脑组织中的表达量最高,在卵巢和精巢中也均有表达;牙鲆kiss2基因在胚胎阶段表达量相对较低,而在孵化后第7 d其表达量显著增高,且在孵化后的第29 d达到高峰。说明牙鲆kiss2基因具有明显的时期和组织差异性表达,其在牙鲆脑中的丰富表达及在精巢和卵巢中的表达表明该基因可能在牙鲆神经系统与生殖中发挥重要作用。

不同Ca^(2+)浓度养殖环境下三角帆蚌外套膜和内脏团组织钙调蛋白基因的表达

为了探索钙调蛋白基因(Ca M)在淡水贝类珍珠形成中的作用,研究0、0.5、1.25、2和3 mmol/L 5个不同Ca^(2+)浓度水环境下养殖三角帆蚌,并在插核后的0、20、50、90和120 d对外套膜和内脏团组织采样,采用荧光定量方法检测组织Ca M表达量。结果表明:(1)在不同Ca^(2+)浓度中,Ca M基因外套膜和内脏团组织在0 mmol/L Ca^(2+)浓度下始终处于过低表达水平;0.5 mmol/L浓度下先降低后升高并维持稳定;1.25 mmol/L浓度下在20 d内脏团出现降低,之后升高至0 d水平并保持稳定;在2mmol/L浓度下表达量在20 d时显著上升达到各浓度中最高后保持高表达量状态;3 mmol/L浓度下在插核后20 d表达量升高,之后时期表达量开始不断降低(P<0.05)。(2)在插核后不同天数中,0 d各浓度表达差异不明显;之后各天数的表达出现明显差异。(3)相同条件养殖下,内脏团Ca M基因表达量高于外套膜。研究发现,0.5 mmol/L和2 mmol/L Ca^(2+)浓度会促进Ca M基因的表达,但0mmol/L和3 mmol/L的浓度则会抑制Ca M基因的表达。内脏团部位更有利于珍珠的形成。

高温与性激素诱导对褐牙鲆kiss2和gpr54-2基因表达的影响

Kisspeptin是调控脊椎动物生殖的重要神经内分泌因子,本实验室先前已鉴定了褐牙鲆kiss2及其受体gpr54-2基因,二者在褐牙鲆脑和性腺中具有较高表达,但其在褐牙鲆早期性腺分化中的作用以及温度、外源激素对其基因表达的影响尚不清楚。因此本研究设置高温(28℃)、雌激素(10μg/L)、雄激素(10μg/L)处理组和常温(20℃)对照组培育性腺分化早期的褐牙鲆幼鱼(45日龄、55日龄和65日龄),利用荧光定量PCR技术分析了高温和性激素诱导对褐牙鲆早期性腺分化过程中kiss2及其受体gpr54-2基因表达的影响。试验结果显示,高温和雌激素处理可以促进褐牙鲆脑中kiss2和性腺中gpr54-2的表达,却下调了褐牙鲆性腺中kiss2的表达;而雄激素处理则使褐牙鲆脑和性腺中kiss2和gpr54-2的表达几乎都受到显著的抑制作用。本研究结果为进一步阐述kiss2和gpr54-2基因在褐牙鲆早期性腺分化中的作用奠定基础。