海洋细菌生物被膜可拉酸含量影响厚壳贻贝稚贝附着

可拉酸是生物被膜上重要的胞外多糖之一,但细菌可拉酸对海洋无脊椎动物附着过程的影响还鲜少研究。本研究从自然生物被膜中分离出8株海洋细菌,对其种属进行鉴定及聚类分析,并测定其生物被膜的可拉酸含量及对稚贝附着的诱导能力。筛选所得海洋细菌形成生物被膜并测定其成膜能力及胞外产物含量,发现β-多糖的生物量与厚壳贻贝稚贝附着率呈显著正相关趋势(p<0.05)。8株海洋细菌生物被膜中可拉酸含量的定量结果显示,3株革兰氏阳性菌无法产生可拉酸,5株革兰氏阴性菌均可检测到不同含量的可拉酸,其中革兰氏阴性菌Shewanella marisflavi的可拉酸含量最高,为1076.43μg/mL。不同可拉酸含量的海洋细菌单一生物被膜与厚壳贻贝稚贝附着率之间关系的研究结果显示,海洋细菌生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着率的诱导效果与其可拉酸含量呈显著正相关(p<0.05)。以上结果表明,细菌生物被膜中的可拉酸能够参与诱导厚壳贻贝稚贝的附着。本研究为探究海洋细菌生物被膜的化学物质与海洋贝类附着之间的相互作用及其对贝类附着机制提出了新的见解。

纤维素对海洋细菌生物被膜形成及厚壳贻贝幼虫附着变态的调控

为探讨纤维素对假交替单胞菌属细菌等在生物被膜形成过程中的生物量和胞外产物的影响,以及生物被膜等生物学特性的改变对海洋无脊椎动物幼虫附着变态的影响,选取对厚壳贻贝Mytilus coruscus幼虫附着变态具有高诱导和中等程度诱导活性的海洋细菌Pseudoalteromonas atlantica、Shewanella loihica,分析了纤维素在细菌生物被膜形成过程中和生物被膜形成后,对生物被膜特性,如细菌密度、膜厚、胞外产物等的影响,以及生物被膜对厚壳贻贝幼虫附着变态的调控作用。结果表明:纤维素对厚壳贻贝幼虫的附着变态无显著性影响(P>0.05),而纤维素与细菌共同形成的生物被膜及纤维素处理的生物被膜对幼虫附着变态的诱导活性均显著下降(P<0.05);通过对生物被膜的特性分析发现,两种纤维素添加方式处理的生物被膜,与野生型单一生物被膜相比,细菌量均明显减少,膜厚降低,胞外多糖、胞外脂含量减少,而胞外蛋白无显著变化(P>0.05)。研究表明,纤维素可通过调控细菌生物被膜的细菌密度、膜厚和胞外产物等特性,最终影响厚壳贻贝幼虫的附着变态。

海洋酸化对贝类的生理生态学影响研究进展

随着工业化进程的发展,温室气体二氧化碳(CO_(2))大量排放,约四分之一被海洋吸收,导致海水pH值和碳酸钙饱和度降低,出现了海洋酸化的现象。海洋酸化及引起的碳酸盐化学体系的变化已对各种海洋生物产生影响。贝类作为海洋生态系统中的代表性生物类群,自身具有一定的酸碱平衡调节能力,但其属于钙化生物,极易受到海水酸化的影响。在对贝类进行酸化生理生态响应的研究中,我们发现海洋酸化影响到贝类整个生活史和几乎大部分生理过程,尤其是早期生活史阶段呈现高度敏感性。本文就目前国内外对贝类在酸化条件下的生理生态响应进行了综述和讨论,为贝类应对海洋酸化响应机制研究提供理论参考。

人工鱼礁表面分离细菌形成单一生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的影响

为探讨存在于人工鱼礁表面的海洋细菌与贝类附着之间的互作关系,本研究从自然海域中的人工鱼礁表面上分离了9株海洋细菌,并分别构建单一细菌生物被膜,探索不同细菌种属形成的生物被膜特性与厚壳贻贝(Mytilus coruscus)稚贝附着之间的关系。结果显示,9株人工鱼礁表面细菌形成的生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的诱导活性存在显著差异,其中,Mesoflavibacter sp.2对稚贝附着的诱导活性最高,Phaeobacter sp.2的诱导活性最低。Sutcliffiella sp.1和Jeotgalibacillus sp.1的细菌密度与诱导活性呈显著正相关,Cytobacillus sp.1和Phaeobacter sp.2的细菌密度与诱导活性呈显著负相关。通过比较分析Mesoflavibacter sp.2和Phaeobacter sp.2生物被膜的蛋白质及多糖含量发现,生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的诱导活性与多糖含量呈显著负相关,与蛋白质含量呈正相关。本研究初步探索了人工鱼礁表面细菌形成的生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的影响,为后续在自然海区进一步解析人工鱼礁表面生物被膜与海洋无脊椎动物附着的互作关系具有重要理论研究意义,同时,对于人工鱼礁表面海洋生物附着机制的研究具有重要的实践价值。

不同来源海洋弧菌微生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的影响

为探讨广泛存在于近海环境中海洋弧菌和贝类附着的相互作用关系,实验从自然微生物被膜和厚壳贻贝成体肠道内分离了海洋弧菌,测定其种属及亲缘性,调查了这些不同来源弧菌形成的微生物被膜与厚壳贻贝稚贝附着的调控作用。结果显示,测试弧菌形成的微生物被膜密度随着初始细菌密度的增加呈现不同程度的增加。源于自然微生物被膜和贻贝肠道内的10株弧菌均能显著促进厚壳贻贝稚贝的附着,不同菌株形成微生物被膜的诱导活性存在显著差异,附着率变化范围为17%~67%,其中稚贝在Vibrio sp.17微生物被膜上的附着率为67%±2%。微生物被膜对稚贝附着诱导活性与被膜密度呈显著相关性,其中弧菌V.crassostreae ECSMB14106的相关性系数最高,为0.8992。此外,微生物被膜的诱导活性与弧菌的来源无关。本实验初步探明了海洋弧菌对厚壳贻贝稚贝附着的影响,有助于进一步理解微生物被膜调控厚壳贻贝的附着分子机理。

鱼类对海洋升温与酸化的响应

自工业革命以来,空气中人为排放CO_(2)量增加,引起温室效应,导致地球表面温度升高和海水升温;同时,由于海⁃气界面气体交换,大气中CO_(2)部分溶解于海洋,引起海洋酸化。海洋升温加快鱼体内生化反应和代谢速率,并通过影响生长、觅食和繁殖等生命过程中能量供给,间接影响到鱼类种群分布、群落结构及生态系统的功能。而海水酸化会干扰海洋鱼类仔稚鱼的感觉和行为,增加其被捕食率,并削弱其野外生存能力,可能威胁自然种群补给量。综述了海洋升温、海洋酸化及其两者共同作用对海洋鱼类的影响,为预测鱼类响应全球海洋环境变化的响应趋势提供相关依据。

细菌运动性对生物被膜的动态演替及其对厚壳贻贝附着的影响

为研究海洋细菌的运动性在生物被膜形成和贝类附着过程中的作用,本研究以厚壳贻贝(Mytilus coruscus)为研究对象,开展了海洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas marina)野生型菌株和ΔcheW菌株不同时间段的运动性能分析,调查了运动性能不同的细菌形成生物被膜的膜厚、细菌密度以及胞外产物的动态变化,探究了其生物被膜的动态演替对厚壳贻贝附着的影响。研究发现,野生型菌株和ΔcheW菌株在6、12、24、48、72和96h等不同时间的运动性能差异显著(P<0.05)。同时,对2株菌株形成菌圈的半径进行测量发现,随着时间的变化,菌圈的半径不断增加,均在96h达到最大。整体上,野生型菌株在不同时间段形成的菌圈大于ΔcheW菌株。在运动性的作用下,2株菌株随着时间的变化形成生物被膜的细菌密度及膜厚在48h达到最大值,在72h后开始扩散。在运动性的影响下,野生型菌株在不同时间段形成的生物被膜对厚壳贻贝附着诱导效果显著高于ΔcheW菌株。在运动性介导下,2株菌株形成生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着率随着时间变化呈现先增长后减少的趋势,在48 h达到最高,在72 h后开始降低,这一结果与不同时间段下形成生物被膜的胞外产物变化一致,且胞外产物分泌与细菌运动性密切相关。因此,运动性影响生物被膜的形成,且在生物被膜动态演替过程中介导了生物被膜的膜厚、细菌密度以及胞外产物的分泌,从而影响了厚壳贻贝的附着。本研究为后续开展细菌运动性、生物被膜形成和厚壳贻贝互作机制研究奠定了基础,为海洋经济物种的生产养殖提供了技术支撑。

1-苯基2-硫脲通过p53调控自噬活性来保护斑马鱼神经丘毛细胞

为了确定细胞自噬与毛细胞存活的关系,通过溶酶体标记物Lyso Tracker对神经丘的细胞自噬进行活体染色发现,斑马鱼(Danio rerio)经过苯基硫脲(PTU)处理后,其神经丘毛细胞Lyso Tracker信号强度增加,并伴随毛细胞数量增多和肿瘤抑制蛋白p53基因(Tumor protein p53 gene,tp53)上调。为了阐明毛细胞的存活和保护机制,通过CRISPR/Cas9技术构建了tp53突变体斑马鱼,发现该基因突变后不会影响斑马鱼神经丘毛细胞的数量,但抑制了PTU对神经丘毛细胞自噬的促进,神经丘毛细胞不再增多。研究结果表明:PTU可以通过上调tp53基因的表达,促进斑马鱼侧线神经丘毛细胞的自噬活性,进而促进毛细胞的存活,为保护毛细胞奠定了重要基础。

肠道细菌对厚壳贻贝稚贝附着的作用研究

为探讨肠道细菌形成的微生物被膜对贝类附着的作用,从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)成体肠道中分离10株肠道细菌,调查厚壳贻贝肠道细菌形成微生物被膜特性,分析微生物被膜密度、细菌种属与厚壳贻贝稚贝附着之间的相互关系。所有肠道细菌均可有效促进稚贝附着。其中,Paracoccus sp.1微生物被膜诱导的稚贝附着率最高(61%),且微生物被膜膜厚较厚,细菌分布较密集;仅5株肠道细菌Roseovarius sp.1、Winogradskyella sp.1、Tenacibaculum sp.4、Bacillus sp.5和Nonlabens sp.1的被膜密度与附着显著相关(P<0.05)。系统发育分析发现肠道细菌诱导附着率与其种属无关。本研究表明源于厚壳贻贝成贝肠道细菌可以促进其稚贝的附着,说明肠道细菌对厚壳贻贝的生长发育具有一定的作用。本研究结果为深入探讨肠道细菌与厚壳贻贝相互作用和推动该种规模化养殖提供理论依据。

低温胁迫对不同品系暗纹东方鲀肠道微生物群落结构的影响

为研究低温下鱼类肠道微生物的多样性,揭示低温胁迫对不同品系暗纹东方鲀Takifugu fasciatus(体质量300 g)肠道微生物群落结构的影响差异,通过持续降低水温,提取耐寒型暗纹东方鲀“中洋1号”(“Zhongyang No.1”)和野生型暗纹东方鲀肠道微生物基因组总DNA,并采用Illumina高通量测序技术检测肠道微生物群落多样性。结果表明:两个品系的暗纹东方鲀肠道内微生物群落组成相似,但丰度不同;“中洋1号”肠道微生物的OTUs、丰富度和多样性均小于野生型暗纹东方鲀,经过长期低温驯化的“中洋1号”肠道微生物种类趋于一致;与野生型暗纹东方鲀相比,“中洋1号”暗纹东方鲀肠道微生物中,弓形杆菌norank_f_Arcobacteraceae、螺旋体属Brevinema细菌相对丰度较高;功能预测显示,“中洋1号”肠道中微生物具有较高的碳水化合物运输与代谢及脂质转运与代谢等功能。研究表明,“中洋1号”肠道微生物多样性低于野生型暗纹东方鲀,随着温度降低,“中洋1号”肠道微生物的多样性也呈现下降趋势,低温对降低鱼类肠道微生物群落多样性组成可能有重要影响。

3种脂肪酸对生物被膜形成及厚壳贻贝幼虫附着变态的影响

为研究脂肪酸对海假交替单胞菌Pseudoalteromonas marina生物被膜形成及共同形成的生物被膜对厚壳贻贝Mytilus coruscus幼虫附着变态的影响,以海假交替单胞菌生物被膜为对照,设置0.01、0.1、1、5 mg/L的棕榈酸(十六烷酸)、硬脂酸(十八烷酸)、油酸(十八烯酸)及3种脂肪酸混合物添加到菌液中共同形成生物被膜,并检测生物被膜对厚壳贻贝幼虫附着变态的影响,同时选取诱导效果较好的3种脂肪酸混合物组对其生物被膜的密度、膜厚及胞外产物进行研究。结果表明:混合脂肪酸与细菌共同形成的生物被膜使幼虫的附着变态率显著上升(P<0.05),通过对混合脂肪酸组生物被膜的生物学特性分析发现,随着混合脂肪酸物浓度的增加,相比海假交替单胞菌单一生物被膜,其细菌密度和膜厚度显著降低(P<0.05),细菌更加分散,胞外脂类含量显著升高(P<0.05),而胞外多糖、胞外蛋白质则无明显变化(P>0.05)。研究表明,脂肪酸是通过促进生物被膜胞外脂的产生影响厚壳贻贝幼虫的附着变态。

维生素B7和B12对细菌生物被膜形成及厚壳贻贝幼虫变态的影响

为探究B族维生素对海洋细菌生物被膜形成、海洋贝类幼虫变态所产生的作用,本研究首先使用维生素B7(VB7)和B12(VB12)直接刺激厚壳贻贝(Mytilus coruscus)幼虫,观察其对变态的直接诱导活性;然后通过添加VB7和VB12,与海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas marina)共同形成生物被膜,分析B族维生素对生物被膜形成及其生物学特性的影响;同时检测生物被膜变化对厚壳贻贝幼虫变态发育的影响。研究结果显示,0.02 mmol/L浓度VB7和VB12可以直接诱导厚壳贻贝幼虫的变态,且效果最为显著(P<0.05);0.02 mmol/L浓度VB7和VB12处理后的海假交替单胞菌生物被膜对幼虫附着变态的诱导作用均显著提高(P<0.05);进一步通过细菌密度计数、膜厚度分析、可拉酸染色和定量等方法,揭示VB7和VB12处理后生物被膜细菌密度、膜厚度以及胞外多糖、蛋白和脂质均显著增加(P<0.05)。研究结果证实,VB7和VB12可能通过改变海洋细菌生物被膜的生物学特性,进而调控厚壳贻贝幼虫变态发育。本研究为探究厚壳贻贝幼虫附着变态的分子机制提供了新的理论依据和创新思路,同时为B族维生素在提高厚壳贻贝人工育苗技术、改善厚壳贻贝养殖产业问题和促进海洋牧场生态修复建设等方面的应用提供了理论基础。

伯氏肩孔南极鱼dusp1基因在冷应激中的功能研究

为了研究极地鱼类双特异性磷酸酶1 (dual-specificity phosphatase 1, dusp1)基因在低温胁迫下的作用,实验采用RT-PCR技术从Trematomus bernacchii中克隆获得了编码区含有1128个核苷酸的dusp1同源基因,可编码376个氨基酸残基。将其通过同源重组的方法构建真核表达载体pcDNA3.1-dusp1并转染至人胚肾293T(HEK293T)细胞中,同时以pcDNA3.1空载质粒作为对照。使用荧光探针DCFH-DA检测了细胞活性氧(Reactive oxygen species assay, ROS)含量,采用流式细胞术检测了低温胁迫下细胞的存活率,采用Western Blot检测了P38/MAPK的磷酸化水平和RT-qPCR技术分析了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的mRNA表达水平。结果表明,伯氏肩孔南极鱼dusp1基因能在293T细胞中大量表达,并定位于细胞核;在低温胁迫下,与对照组相比,伯氏肩孔南极鱼dusp1基因的过表达能显著减少细胞ROS的含量和细胞凋亡率,并抑制促凋亡基因P38/MAPK的过度磷酸化和凋亡效应基因caspase-3的上调,减轻细胞在低温下的受损程度。研究表明伯氏肩孔南极鱼dusp1的过表达提高了293T细胞的抗寒能力,在细胞低温应激过程中具有保护功能。研究结果为探究极地鱼类低温适应性进化研究提供了新的证据,同时也为进一步探究冷胁迫下硬骨鱼类dusp1的功能奠定了基础。

海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas marina)鞭毛蛋白对生物被膜形成及厚壳贻贝附着的影响

大多数海洋无脊椎动物在发育过程中都经历浮游、底栖附着阶段,厚壳贻贝(Mytilus coruscus)作为海洋经济物种与大型污损生物,其附着机制受到广泛关注。为探究海洋细菌与厚壳贻贝附着的互作关系,选取了对厚壳贻贝稚贝附着具有较高诱导活性的海洋细菌--海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas marina),采用酸解超速离心法提取P.marina的鞭毛蛋白。将提取的鞭毛蛋白与琼脂糖溶液混合,形成凝胶直接刺激稚贝;再用提取的鞭毛蛋白处理P.marina生物被膜进行稚贝附着实验。通过共聚焦激光扫描分析形成的生物被膜上生物量、细菌密度和胞外产物含量的变化。结果表明:P.marina鞭毛蛋白与琼脂糖形成的混合凝胶可显著促进厚壳贻贝稚贝的附着;鞭毛蛋白处理的生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的诱导活性显著提高;生物被膜上的生物量、细菌密度、膜厚、胞外β-多糖、脂质和蛋白浓度都有所增加。研究表明,鞭毛蛋白可以直接调控厚壳贻贝稚贝的附着,也可通过改变P.marina生物被膜的生物学特性,间接影响厚壳贻贝稚贝的附着,为探究细菌鞭毛蛋白与厚壳贻贝附着互作机制提供理论依据。

不同浮游植物叶绿素a提取方法的比较研究

针对浮游植物叶绿素a(Chla)测定中遇到的纤维素滤膜溶解、样品保存时间和提取方法差异等影响测定结果的问题,选择了3种单胞藻:蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidesa)、亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)和牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri),分析了不同滤膜、提取溶剂、提取方法、样品保存时间等条件对Chla测定结果的影响。研究显示,使用玻璃纤维滤膜的测定结果最稳定;90%丙酮对蛋白核小球藻Chla提取效果不好,但对亚心形扁藻和牟氏角毛藻提取效果较好;冻融法提取牟氏角毛藻和亚心形扁藻Chla的效果好于研磨法;加入提取溶剂12 h后测得Chla浓度值最高,样品-20℃保存15 d后Chla浓度测定结果显著降低。结果表明,采用玻璃纤维滤膜过滤水样、冻融法提取12~24 h后Chla浓度测定效果最好,蛋白核小球藻应采用研磨法提取Chla,水样抽滤后保存时间不宜超过15 d。研究结果可为海水Chla浓度的分析测定提供参考资料。

藻酸盐对海假交替单胞菌生物被膜形成及厚壳贻贝附着变态的影响

为探究藻酸盐对海假交替单胞菌Pseudoalteromonas marina生物被膜形成及厚壳贻贝Mytilus coruscus幼虫附着变态的影响,以海假交替单胞菌生物被膜为对照组,将终质量浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L的藻酸盐标准品溶液,分别添加到海假交替单胞菌菌液中共同形成生物被膜,检测生物被膜对厚壳贻贝幼虫附着变态的影响,并分析了藻酸盐对生物被膜的膜厚及胞外产物的影响。结果表明:生物被膜的细菌密度随添加藻酸盐质量浓度的增加而增加;当添加藻酸盐质量浓度为0.5 mg/L时,共同形成的生物被膜的膜厚和胞外多糖均显著增加(P<0.05),诱导厚壳贻贝幼虫附着变态的能力增强。研究表明,添加藻酸盐能够促进P.marina生物被膜的形成,且可拉酸等其他胞外多糖含量的增加促进了生物被膜对厚壳贻贝幼虫附着变态的诱导能力,藻酸盐的适宜添加量为0.5 mg/L。

厚壳贻贝肠道细菌的生物被膜对其幼虫和稚贝附着的影响

为研究肠道细菌在厚壳贻贝(Mytilus coruscus)幼虫和稚贝生长发育过程中的作用,本研究从成体厚壳贻贝肠道中分离出了10株细菌,通过分别形成单一细菌生物被膜,检验其对厚壳贻贝幼虫和稚贝附着的影响和生物被膜特性。实验结果发现,10株肠道细菌所形成的生物被膜均能诱导厚壳贻贝幼虫和稚贝的附着,但不同种类肠道细菌的诱导能力不同,其中Bacillus sp.4对厚壳贻贝幼虫具有高诱导活性,Phaeobacter sp.1具有低诱导活性;Phaeobacter sp.1对厚壳贻贝稚贝具有高诱导活性,Bacillus sp.4具有低诱导活性。通过比较分析Bacillus sp.4和Phaeobacter sp.1生物被膜的生物量及胞外产物发现,肠道细菌被膜细菌密度、膜厚和胞外脂类对厚壳贻贝幼虫的附着变态无影响,而胞外蛋白和胞外多糖可以影响幼虫的附着变态;对于厚壳贻贝稚贝的附着,肠道细菌被膜细菌密度、膜厚和胞外α-多糖均能影响其诱导活性,而胞外脂类和胞外蛋白无影响。本研究成果可为提高厚壳贻贝的健康生态养殖相关技术提供相关的指导,为解析生物被膜调控厚壳贻贝附着机制和该物种生态健康养殖提供理论依据。

钙离子对海假交替单胞菌生物被膜形成及厚壳贻贝附着的影响

为了研究钙离子对海假交替单胞菌Pseudoalteromonas marina生物被膜形成及厚壳贻贝Mytilus coruscus稚贝附着的影响,本试验中使用人工海水,设置与自然海水钙离子浓度相近的10 mmol/L对照组,以及钙离子浓度分别为0、1、5、20、50 mmol/L的5个试验组,分析了钙离子浓度对海假交替单胞菌生物被膜细菌密度、细菌形态、分布和膜厚,以及稚贝(壳长为0.56 mm±0.03 mm)附着的影响,并使用共聚焦显微镜技术对不同钙离子浓度影响下被膜的胞外多糖、胞外脂类和胞外蛋白进行了分析。结果表明:用10 mmol/L钙离子浓度培养的海假交替单胞菌生物被膜的细菌密度、膜厚和胞外产物生物量均最高,其余钙离子浓度下均降低;用10 mmol/L钙离子浓度培养的海假交替单胞菌生物被膜诱导了最高的稚贝附着率,与对照组相比,在较高或较低钙离子浓度下培养的生物被膜均表现出较低的稚贝附着率。研究表明,过高或过低的钙离子浓度可导致海假交替单胞菌生物被膜的形成能力显著降低,并随后抑制厚壳贻贝稚贝附着。

2个重组海带α-碳酸酐酶(CA)的酶活性比较研究

为了探究海带(Saccharina japonica)α-CA1和α-CA2是否具有催化CO_(2)的可逆水合反应和酯酶活性,作者通过原核表达得到这两种α-CA的可溶性的异源重组蛋白。分别用电极法和酯酶活性检测法来检测重组α-CA1(rα-CA1)和rα-CA2的水合酶活性和酯酶活性,结果发现,rα-CA1的水合酶活性(1.52±0.120U/mg)几乎是rα-CA2(0.54±0.046U/mg)的3倍,表明rα-CA1催化CO_(2)的水合能力明显大于rα-CA2。而两者的酯酶活性并没有显著的差别(rα-CA1比活力:0.697±0.176U/g,rα-CA2比活力:0.743±0.129 U/g),说明催化乙酸对硝基苯酯(p-NPA)生成对硝基苯酚(p-NP)的能力是没有显著差别的。实验结果证实这2个α-CA为功能蛋白,可能参与海带无机碳吸收和储存过程,因此,本研究为海带无机碳吸收和储存机制的解析提供了生物化学依据。

斑马鱼软骨内骨化过程中骨骼的转录组测序分析

为研究斑马鱼(Danio rerio)骨骼发育时期关键调控基因及复杂的调控网络,采用阿尔辛蓝-茜素红双重染色方法对受精后50 d(day post fertilization,dpf)和65 dpf野生型斑马鱼骨骼进行染色,提取50 dpf和65 dpf斑马鱼骨骼的总RNA进行转录组测序,对差异表达基因进行筛选并进行GO功能注释和KEGG富集分析。结果表明:50 dpf斑马鱼头骨正在经历软骨内骨化,而65 dpf斑马鱼软骨内骨化过程基本完成;对50 dpf与65 dpf斑马鱼骨骼进行转录组测序,共产生41.44×109个有效数据,存在610个差异表达基因,相比50 dpf斑马鱼,65 dpf斑马鱼骨骼中软骨发育相关基因(dlx2a、foxd3和sec23b)、骨矿化调节基因(ptk2bb)、骨骼细胞分化正调控基因(dlx2a)均下调,表明其骨骼发育已较为成熟,骨细胞分化过程减少,与阿尔辛蓝-茜素红双重染色结果相一致;进一步对这些差异表达基因进行GO功能注释和KEGG富集分析,发现大部分差异表达基因与代谢网络、生殖信号通路相关;随机选取了6个差异表达基因进行实时荧光定量qRT-PCR验证,发现这些基因表达趋势与测序结果一致,这表明转录组测序结果真实可信。研究表明,鱼类与哺乳动物一样,其代谢、骨骼和生殖功能三者间存在密切联系,其内在机制为研究斑马鱼骨骼发育与疾病治疗提供了一个新的思路。