ELISA法筛查食源性致病菌特异性抗体的影响因素探讨及其应用

目的探讨食源性致病菌抗体制备中的间接ELISA筛查法的最佳工作条件并建立标准化操作流程。方法选择不同抗原包被量和包被液,设置了2个主要的孵育时间和16组孵育温度,通过比较各个不同条件的S/N比值大小从而确定最佳工作条件。结果食源性致病菌特异性抗体制备中的ELISA筛选法最佳工作条件为:尽可能选择高浓度细菌进行抗原包被,抗原包被液采用细菌培养液,37℃包被8h以上,一抗和二抗与抗原间的作用时间均为37℃孵育1h。上述ELISA筛选法也适用于蛋白质包被抗原的特异性细胞株筛选研究。结论建立了ELISA筛查法的标准流程,该方法不仅适用于菌体抗原也适用于蛋白质抗原的特异性杂交瘤细胞的筛选研究。

副溶血性弧菌三种主要溶血毒素表达体系的构建研究

目的构建副溶血性弧菌三种主要溶血毒素(TDH、TRH和TLH)的重组融合表达体系,给后续这三种溶血毒素的大量获取及其特异性抗体的制备、副溶血性弧菌的致病机理等研究提供基础材料。方法首先将副溶血性弧菌标准菌株tdh、trh与tlh基因分别接入克隆载体pGM-T,并转入E.coliTOP10,进行BamHI、HindIII双酶切鉴定和克隆测序。然后从重组克隆质粒中将tdh、trh与tlh基因目的片段分别双酶切出,将其连接到带His标签的表达载体pET30a(+)中后转入E.coliBL21(DE3)中,先通过BamHI、HindIII双酶切以鉴定所构建表达载体的准确性。接着重组表达菌株经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE电泳和Western-blotting来分析鉴定表达结果。结果表达产物的SDS-PAGE电泳结果显示TDH在29000、TRH在30000、TLH在52000附近处出现明显的表达蛋白条带。利用His标签的特异性抗体进行Western-bloting分析,实验结果显示29000、30000、52000附近处的表达蛋白与His抗体均有特异性反应。结论成功构建了TDH、TRH和TLH溶血毒素的原核表达体系,为进一步免疫原性和特异性抗体制备奠定基础。