酶法合成5-杂氮-2’-脱氧胞苷

将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)中的N-脱氧核糖转移酶II的基因(ntd)克隆到大肠杆菌BL21(DE3)中,构建原核表达系统,成功地得到一株大量表达N-脱氧核糖转移酶II的菌株PND。以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂,该重组菌可大量表达N-脱氧核糖转移酶II。在此酶作用下,以5-杂氮胞嘧啶和脱氧胸苷为底物,生成胸腺嘧啶和目标产物5-杂氮-2’-脱氧胞苷。最佳反应条件为:底物浓度均为2 mmol/L,20 mmol/LTris-HCl缓冲液(pH为7.1),200μL酶,最终反应体积2 mL,55℃反应2 h,转化率可达61%。

大肠杆菌腺苷脱氨酶基因的克隆表达

将大肠杆菌K12菌株来源的腺苷脱氨酶基因(add)克隆到载体pET-28a中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。通过IPTG诱导,SDS-PAGE检测和酶活性的测定发现,重组菌表达产生大量腺苷脱氨酶,活性达到51.07U/mg蛋白。通过酶性质的研究,腺苷脱氨酶对腺苷最适pH和温度分别为7.5和40℃,且在40℃下维持稳定。

胞苷生产菌的选育及发酵

目的选育胞苷脱氨酶缺失枯草芽孢杆菌,提高胞苷发酵单位,并对间歇补料分批发酵方式进行了初步研究。方法(1)以胞苷脱氨酶缺失枯草芽孢杆菌CDS36为突发菌株,对其进行紫外诱变,经6-杂氮尿嘧啶(6AU)、5-氟胞苷(5FCR)等进行定向抗性筛选;(2)采用间歇补料分批发酵,葡萄糖初始浓度10.0%,48h后补加10.0%,72h补加5.0%的补料方式培养,并测定发酵单位。结果(1)通过紫外诱变和抗性筛选得到了6-杂氮尿嘧啶、5-氟胞苷抗性的突变株CDS36-800-17,抗6-杂氮尿嘧啶和5-氟胞苷的临界浓度分别为1000mg/L和800mg/L;(2)通过间歇补料分批发酵方式发现培养96h,胞苷发酵单位可达4.86g/L,培养120h可达5.58g/L,比未经补料分批发酵时提高了20.0%。结论(1)筛选获得胞苷发酵单位较高的突变株CDS36-800-17,并具有较好的遗传稳定性,可稳定发酵;(2)间歇补料分批发酵方式可提高胞苷产量。