人凝血因子Ⅸ的研究进展

人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ，FⅨ）是一种维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶原，在内源性凝血级联反应中起重要作用。FⅨ缺乏或功能异常会导致血友病B。此文综述了FⅨ的基因和蛋白结构，以及FⅨ用于血友病B治疗的研究现状。

干热法对人血浆血管性假血友病因子冻干品中病毒灭活效果的观察

目的探讨干热灭活法(dry heat treatment)对血管性假血友病因子(von willebrand factor,v WF)中猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)的灭活效果。方法以PPV或EMCV作为灭活指示病毒与v WF混合,并分别在(80±1)℃4、8、12、24、36、48、72 h,(90±1)℃4、12、24、36、48 h以及(99±1)℃5、15、30 min进行干热灭活处理。将在干热灭活前以及干热灭活后不同温度时间段的v WF样品接种ST细胞(swine testis)或Vero细胞培养,观察细胞病变(cytopathic effect,CPE),用Reed-Muench法计算残余PPV和EMCV的病毒滴度。对无CPE的样品进行盲传3代培养,验证其灭活效果,并检测干热处理前后的v WF活性。结果v WF中EMCV滴度在(80±1)℃、(90±1)℃以及(99±1)℃灭活条件下,均下降超过4.0 lg TCID_(50)/0.1 m L,v WF中PPV的滴度下降也均超过4.0 lg TCID_(50)/0.1m L。干热法灭活后v WF的活性下降<20%,质量稳定。结论干热法可以灭活v WF中的PPV以及EMCV,且对样品的活性影响在允许范围之内。

短波紫外线对人凝血因子Ⅷ中猪细小病毒灭活的研究

目的 研究短波紫外线（short-wave ultraviolet C，UV-C）对人凝血因子Ⅷ（human coagulation factor Ⅷ ，FⅧ）中猪细小病毒（porcine parvovirus ，PPV）的灭活的效果。方法 将PPV作为指示病毒与FⅧ中间品混合，用紫外灭活仪UVivatec分别以200、300 和400 J/m2 UV-C进行灭活。将UV-C灭活的FⅧ接种ST细胞并进行培养，采用细胞病变（cytopathic effect，CPE）法检测病毒，并以Reed-Muench法计算病毒滴度。对所有UV-C灭活后未出现CPE的样品盲传3 代，验证灭活效果；同时对UV-C灭活前后的FⅧ活性进行检测。结果 3个照射剂量的UV-C灭活后，FⅧ中的PPV滴度降低均0.1 ml ≥4.62 lg半数组织培养感染剂量，所有未出现CPE的样品盲传至第3代均未检到病毒。UV-C灭活的FⅧ的活性无明显降低，且各项质量指标均符合药典的要求。结论 UV-C可有效灭活无包膜病毒 PPV，且对FⅧ活性无明显影响。

优化的α1-抗胰蛋白酶生物活性测定方法的验证

目的 验证优化的α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin,α1-AT）生物活性测定方法.方法 用发色底物法测定α1-AT活性,以牛胰蛋白酶替换冻干正常人血清来优化先前建立的方法,验证优化方法的准确性、重复性,并观察不同物质对优化方法的影响.结果 优化方法在胰蛋白酶质量浓度为0.01～0.05 g/L时线性关系良好,相关系数＞0.99.优化方法具有良好的准确性和重复性,当采用优化方法测定质量浓度为0.01、0.03、0.05 g/L胰蛋白酶时,胰蛋白酶的回收率分别为99.33％、94.44％和92.67％,变异系数分别为3.79％、1.66％和1.02％.在一定范围内,聚乙二醇、蔗糖、枸橼酸钠、人白蛋白浓度变化对优化方法测定α1-AT生物活性没有影响.结论 以牛胰蛋白酶作为参考标准品的优化α1-AT生物活性测定方法可用于α1-AT制备工艺中的常规质量控制.

静脉注射人免疫球蛋白工艺中的病毒灭活方法初探

目的 研究静脉注射人免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin,IVIG）工艺中辛酸处理联合20 nm膜过滤的病毒灭活/去除方法.方法 分别将脂包膜Sindbis病毒和伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）加入pH（4.6±0.1）和pH（5.3±0.1）IVIG中间品（辛酸沉淀后上清液）,在（7.47±0.39）、（14.47±0.39）和（22.47±0.39） mmol/L辛酸条件下维持（25±1）℃处理120min;将非脂包膜猪细小病毒（porcine parovirus,PPV）加入pH（6.0±0.2）MG中间品（层析流穿液）,用20 nm膜过滤.检测所有样品处理前后的病毒滴度.结果 （25±1）℃处理120m in后,pH（4.6±0.1）IVIG中间品分别经（7.47±0.39）和（14.47±0.39） mmol/L辛酸钠处理后的残余病毒滴度均≤0.501g,pH（5.3±0.1）IVIG中间品分别经（14.47±0.39）和（22.47±0.39） mmol/L辛酸处理后的残余病毒滴度均≤0.50lg;20 nm膜过滤可使MG中间品的PPV滴度下降≥4.00lg.2种处理方法的结果均符合相关规定的要求.结论 在一定条件下,辛酸处理联合20 nm膜过滤可有效灭活/去除MG生产过程的相关病毒.

一次性无菌转移系统在人凝血因子Ⅷ生产中的应用

目的 评价一次性无菌转移系统（Allegro系统）用于人凝血因子Ⅷ（human coagulation factorⅧ,FⅧ）生产的可行性.方法 设计基于Allegro系统的一次性无菌转移系统,并对该系统进行各项验证.将该系统用于FⅧ生产并检测FⅧ的各项质量指标和稳定性.结果 Allegro系统的各项验证结果均符合规定的要求,且Allegro系统对制品的理化性质没有影响.Allegro系统的主要溶出物为叔丁醇和三甲基硅醇,溶出物含量分别为＜3.0 mg/袋和＜4.5 mg/袋,符合规定的安全性要求.采用Allegro系统生产的3批FⅧ的各项质量指标符合规定的标准,且FⅧ的稳定性良好.结论 一次性无菌转移系统（Allegro系统）可用于FⅧ生产.

人纤维结合蛋白制备方法的建立及人纤维结合蛋白稳定性初探

目的 建立人纤维结合蛋白（fibronectin,Fn）制备方法,研究不同保护剂对Fn稳定性的影响.方法 将经磷酸盐缓冲液抽提溶解的血浆冷沉淀用聚乙二醇沉淀,获得的上清液经离子交换层析制得纯化的Fn.将加入复合保护剂的Fn溶液分别于-20、4和37℃存放0、5和14 d,观察保护剂抑制Fn降解的效果.结果 采用建立的方法制备的Fn的纯度和平均回收率均＞80％.Fn稳定性研究显示,Fn于4℃存放会发生降解,加入枸橼酸钠＋甘氨酸或枸橼酸钠＋咪唑复合保护剂能有效抑制Fn降解.结论 采用建立的方法制备Fn是可行的.枸橼酸钠＋甘氨酸或枸橼酸钠＋咪唑复合保护剂对Fn具有保护作用.

以强阴离子交换剂FG TMAE为介质的离子交换层析制备人凝血因子Ⅷ的初探

目的初步探索以强阴离子交换剂FGTMAE为介质进行离子交换层析来制备人凝血因子Ⅷ。方法以含不同氯化钠浓度的洗脱液进行线性梯度来初步确定离子交换层析的条件，并优化离子交换层析的洗涤液和洗脱液的离子强度和pH值以及样品的温度，最终确定以强阴离子交换剂FGTMAE为介质进行离子交换层析的最适条件。结果在室温（20～25℃）条件下，以pH7．0的含220mmol／L氯化钠的洗涤液和pH7．0的含450mmol／L氯化钠的洗脱液进行离子交换层析，可使人凝血因子Ⅷ的回收率（77．53％）和比活性（24．67IU／mg）均较高。结论以强阴离子交换剂FG TMAE为介质进行离子交换层析制备人凝血因子Ⅷ是可行的。

人血浆载脂蛋白AⅠ的纯化

目的 初探大规模纯化人血浆载脂蛋白AⅠ（apolipoprotein A Ⅰ,ApoA Ⅰ）的低成本生产工艺.方法 以人血浆组分Ⅳ为原料,通过等电点沉淀、阴离子层析、低温乙醇沉淀和超滤等步骤纯化ApoA Ⅰ蛋白,并放大实验室纯化方法来纯化ApoA Ⅰ.结果 放大纯化方法生产的ApoA Ⅰ的得率和纯度分别为59.0％和85.6％,经相关方法验证为人血浆ApoAⅠ.结论 实验室方法放大的纯化工艺可纯化ApoA Ⅰ.

α1抗胰蛋白酶缺乏症及其治疗

α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）是一种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，其缺乏所致的AAT缺乏症（AAT deficiency，AATD）可引起肺部和肝脏疾病。目前治疗AATD相关的肺部疾病的常用方法是静脉注射人血AAT制剂，一些治疗AATD的新方法也在不断开发。此文就AATD的治疗研究做一综述。