NGX6基因转染对鼻咽癌细胞基因表达谱的影响

鼻咽癌是我国南方的常见肿瘤 .NGX6是新近克隆的定位于 9p2 1 2 2 ,在鼻咽癌组织中表达下调的基因 .初步的研究结果显示 ,NGX6基因转染鼻咽癌细胞HNE1能够延缓其生长速度 ,使肿瘤细胞更多地停留在G0 G1期 .为探索NGX6基因在鼻咽癌发病机制中的作用 ,建立了高表达NGX6的鼻咽癌细胞系 .利用包含 14 0 0 0个基因的cDNA微阵列分析了NGX6基因转染对HNE1细胞基因表达谱的影响 ,发现NGX6基因的转染能够上调p2 9、APC7、NEU1、RNasek6、αE catenin和TFⅡEα等基因的表达 ;同时也下调properdinP因子、G0S2、BAZ2B、ZHX1,OS4和PBX3等基因的表达 .研究结果提示 ,NGX6基因对鼻咽癌细胞的生物学行为的影响可能与它对一些细胞周期调控因子和转录调控因子的影响相关 .作为一种高通量的分析技术 。

青蒿琥酯对乳腺癌MCF-7细胞抗失巢凋亡的影响

目的:探讨青蒿琥酯对乳腺癌细胞抗失巢凋亡的影响。方法:采用不同浓度的青蒿琥酯处理乳腺癌MCF-7细胞,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记法(TUNEL)法检测乳腺癌细胞抗失巢凋亡,采用软琼脂集落形成试验检测细胞的生长增殖。结果:青蒿琥酯能有效地抑制乳腺癌MCF-7细胞锚着不依赖性增殖,且呈浓度依赖性。乳腺癌细胞经青蒿琥酯处理后,可促进失巢凋亡,且与时间和浓度相关。结论:青蒿琥酯可有效地抑制乳腺癌细胞锚着不依赖性增殖,其机制可能与促进失巢凋亡有关。

蟾蜍灵对结肠癌SW-480细胞polo-like kinase-1表达及细胞凋亡的影响

目的:观察蟾蜍灵对人结肠癌细胞系增殖的抑制作用,并探讨其作用机理。方法:采用不同浓度的蟾蜍灵作用结肠癌SW-480细胞后,采用MTT法检测细胞的恶性增殖,分别采用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡情况,分别采用Westernblotting、Northernblotting分别检测polo-likekinase-1(PLK1)蛋白、mRNA水平。结果:蟾蜍灵能抑制结肠癌细胞的恶性增殖,且与浓度相关。蟾蜍灵能诱导结肠癌细胞凋亡,且呈浓度依赖性。流式细胞仪检测发现,蟾蜍灵将细胞阻滞在G2/M期。蟾蜍灵能下调结肠癌PLK1蛋白、mRNA水平,且呈药物浓度和作用时间依赖性。结论:蟾蜍灵有效地抑制结肠癌SW-480细胞增殖,其机制可能与其下调PLK1表达,从而诱导凋亡有关。

RARΒ基因转染对胃癌细胞株MKN-45凋亡和存活素及半胱氨酸酶的影响

目的:研究RARΒ受体基因转染后,全反式维甲酸(ATRA)对低维甲酸反应性胃癌细胞系MKN-45 细胞凋亡的影响和可能机制。方法:脂质体介导真核表达载体PCMV-SCRIPT-RARΒ转染MKN一45细胞株,筛选得到阳性克隆,WESTERN BLOTTING鉴定转染成功后给予RARΒ受体相应配体ATRA,MTT法测定细胞增殖水平,分别采用 NORTHERN BLOTTING、WESTERN BLOTTING检测存活素(SURVIVIN)MRNA和蛋白水平,用酶标仪比色法检测半胱氨酸酶(CASPASE)活性,采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果:ATRA可使RARΒ受体高表达的MKN-45细胞株增殖减慢,能下调SURVIVIN MRNA和蛋白水平,增强CASPASE酶活性,并诱导胃癌细胞凋亡,效果呈浓度和作用时间依赖性。结论:RARΒ受体转染并结合使用相应配体ATRA可诱导MKN-45胃癌细胞凋亡,可能与下调SURVIVIN表达与增强CASPASE酶活性有关。

癌胚抗原启动子控制胞嘧啶脱氨酶基因体外对结肠癌细胞专一性杀伤

目的 :研究癌胚抗原 (CEA)启动子是否能控制大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (EC CD)基因在CEA阳性结肠癌细胞中专一性表达和杀伤结肠癌细胞。方法 :构建由CEA启动子驱动的含EC CD基因的重组腺病毒载体AdCEACD与由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的含EC CD基因的腺病毒载体AdCMVCD ,分别感染CEA阳性的人结肠癌细胞株Lovo细胞和CEA阴性的Hela细胞 ,用RT PCR法检测受染细胞中EC CD基因的表达 ,并用MTT法检测感染后细胞对 5 氟胞嘧啶 (5 FC)的敏感性。结果 :Lovo细胞在AdCMVCD及AdCEACD感染后均有EC CDmRNA表达 ,且对 5 FC的敏感性明显增强 ,Hela细胞在AdCMVCD感染后有EC CDmRNA表达 ,对 5 FC的敏感性增强 ,而在AdCEACD感染后则没有EC CDmRNA表达 ,5 FC对其亦无杀伤作用。结论 :CEA启动子能够控制EC CD基因专一性地在CEA阳性的结肠癌细胞中表达 ,从而实现EC

鼻咽癌上皮细胞株HNE1差异表达基因的分离与鉴定

为了分离鼻咽癌差异表达基因 ,应用抑制性扣除杂交技术 ,在正向抑制性扣除杂交中 ,以鼻咽癌上皮细胞株HNE1cDNA作为检测子 ,以人胚鼻咽上皮细胞cDNA作为驱赶子 ;在反向抑制性扣除杂交中 ,以人胚鼻咽上皮细胞cDNA作为检测子 ,以鼻咽癌上皮细胞株HNE1cDNA作为驱赶子 ,分别通过抑制性扣除杂交 ,构建了鼻咽癌上皮细胞株HNE1表达下调和表达上调的两个扣除cDNA文库 .从鼻咽癌相关的扣除cDNA文库中随机挑取 1 2 0 0个克隆 ,采用菌落PCR扩增其插入cDNA片段 ,自动点膜制备成cDNA微阵列膜 ,分别用鼻咽癌上皮细胞株HNE1、人胚鼻咽上皮mRNA经逆转录标记cDNA探针 ,分别与cDNA微阵列膜杂交 ,通过杂交信号的自动扫描分析 ,对杂交信号存在 5倍差异的克隆进行测序 ,获得了 1 0个鼻咽癌差异表达基因的cDNA片段 ,其中 3个为新基因序列 ,其GenBank登录号为 :AF5 1 0 1 88、AF5 1 0 1 89和AF5 1 0 1 90 ,7个代表已知基因序列 .采用RT PCR证实S1 0 0A8,CK1 9和RBP1基因在人胚鼻咽上皮中高表达而在鼻咽癌细胞株HNE1中低表达 .

人γ-干扰素基因修饰的结肠癌细胞株的建立

目的建立人γ-干扰素(IFN-γ)基因修饰的结肠癌细胞株.方法用逆转录病毒质粒pL(IFN-γ)SN将人IFN-γ基因转导入人结肠癌细胞株Lovo中,用G418进行筛选.结果筛选得到抗性克隆Lovo/IFN-γ,能在0.6 g.L^(-1)G418中稳定生长;Lovo/IFN-γ生长曲线与野生型Lovo无异;RT-PCR证实IFN-γ基因在Lovo/IFN-γ中表达;Lovo/IFN-γ能分泌人IFN-γ,细胞内水平为3.0fg.d^(-1).结论成功建立了人IFN-γ基因修饰的结肠癌细胞株,为进一步研究奠定了基础.

胞嘧啶脱氨酶基因联合干扰素-酌基因治疗大肠癌的实验研究

目的:研究胞嘧啶脱氨酶基因(EC鄄CD)联合干扰素-酌(INF鄄酌)基因对大肠癌的治疗作用。方法:以重组腺病毒载体AdCMVCD转导EC鄄CD基因;AdCMVINF鄄γ转导鼠INF鄄γ基因。采用体外培养和小鼠移植瘤实验,研究EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因对CT26大肠癌细胞的杀伤作用。结果:AdCMVIFN鄄γ感染对CT26细胞生长有明显的抑制作用。AdCMVCD/5鄄FC联合AdCMVINF鄄γ可以增强对CT26细胞的杀伤作用,IC50明显变小(P<0.01),肿瘤生长明显抑制(P<0.01)。组织学检查显示,EC鄄CD基因与INF鄄γ基因联合治疗后肿瘤内有大量淋巴细胞浸润。结论:EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因可以明显增强抗肿瘤效应,局部淋巴细胞浸润增加可能起到一定作用。

左旋多巴和多巴胺对中脑原代细胞的毒性作用

目的 :观察左旋多巴和DA对中脑原代培养细胞的毒性作用。 方法 :采用大鼠胚胎中脑原代细胞培养法 ,运用TH免疫荧光染色和 [3H]DA摄取率检测DA能神经元的存活数和功能 ;GFAP免疫荧光染色检测星形胶质细胞的存活数 ;以及MTT检测非DA能神经元的存活数。 结果 :左旋多巴或DA处理后的TH阳性和GFAP阳性细胞数以及细胞存活率均显著低于加药前基数 ,且呈剂量依赖性 ;同时残存细胞体积变小 ,突起减少、变短或断裂。TH阳性细胞和GFAP阳性细胞比非DA能神经元更易受损。结论

膀胱移行细胞癌抗凋亡因子生存素拼接变异体的表达

目的探讨生存素(survivin)拼接体在膀胱移行细胞癌的表达情况及其与肿瘤分期、分级的关系。方法30例膀胱移行细胞癌患者中,Ta/T1期17例,T2～T4期13例;G1/G2级23例,G3级7例;配对的癌旁组织8例;另有8例正常膀胱黏膜取自非肿瘤患者。采用TRIzol一步法提取总RNA,逆转录合成cDNA,再进行PCR扩增。所有标本用GAPDH mRNA作内对照,目的PCR条带用BIO-RAD Quantity One4.5软件根据面积与吸光度定量分析。结果30例膀胱移行细胞癌标本有28例检测到生存素及其拼接变异体(生存素-△Ex3和生存素-2B) mRNA的表达,阳性率为93.3%。生存素为主要的转录本(0.712±0.120),生存素-△Ex3(0.101±0.029)和生存素-2B(0.214±0.076) mRNA为低水平表达,三者的表达水平有显著性差异(P<0.01)。与正常膀胱黏膜和癌旁组织相比,膀胱癌组织生存素及其拼接变异体mRNA的表达水平均明显增高(P<0.01)。而生存素-2B mRNA表达水平在浸润性、高级别癌明显低于非浸润性、低级别癌(P<0.01)。结论生存素拼接变异体可表达于膀胱癌组织,且生存素-2B在浸润性、高级别膀胱癌中表达降低,推测其抗凋亡活性较生存素和生存素-△Ex3为低。

胃腺癌差异表达基因的cDNA微阵列研究

目的:应用cDNA基因芯片研究筛选人胃腺癌相关差异表达基因,探讨胃癌发生、发展的分子机制.方法:运用含18000个基因克隆的cDNA膜基因芯片,对6对胃腺癌及正常胃组织标本分别进行杂交检测并对比分析.结果:6对人胃腺癌与相对应的胃正常组织相比较,筛选出在3～6对标本中有2倍以上改变的基因克隆共有103条(1条在所有标本中均差异明显),其中胃癌组织表达上调基因56条,胃癌组织表达下调基因47条.结论:人胃腺癌癌变是一个多基因参与的过程,基因芯片技术是一种快速有效的筛选人胃腺癌差异表达基因的方法.

联合survivin反义寡核苷酸和基因重组融合蛋白对人膀胱癌细胞的抑制作用

目的用体外实验探讨联合应用survivin反义寡核苷酸、基因重组融合蛋白TP40是否对膀胱移行细胞癌T24细胞具有协同抑制作用。方法实验分为对照组、错义寡核苷酸组(MS)、反义寡核苷酸组(AS)、TP40组和联合组(AS+TP40)。RT-PCR和Western blot法检测各组细胞survivin的表达;MTT法检测各组细胞生长情况;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;体外成瘤实验检测各组细胞的体外锚定非依赖性生长能力。处理时间为3天。结果所合成AS(300nM)对survivin mRNA的表达具有明显抑制作用。分别从转录水平和表达水平证明了联合组下调survivin的能力最强。MTT法显示联合组用药后生长抑制更加明显(P<0.0001),第3天细胞存活率仅12.2%,凋亡率达到96.37%。在软琼脂糖体外成瘤实验中,TP40组和AS组的体外锚定非依赖性生长的能力大大降低,联合组(TP40+AS)细胞几乎没有形成克隆。结论采用survivin反义寡核苷酸封闭survivin的表达,可以增强TP40对膀胱移行细胞癌T24细胞的生长抑制作用,呈现协同效应。

RNA在生物学的重要地位及其作为常规治疗药物的研究进展

20多年来的研究发现,RNA除了具有如tRNA、rRNA参与蛋白质生物合成的基本功能外,细胞内还存在许多种类的RNA,它们执行着不同的功能,在细胞内生物化学反应及机体发育调控过程中发挥着重要作用。正因为RNA功能多样性,在体内、体外开展的众多实验表明,RNA或其修饰形式可以抑制基因的表达。该文将探讨RNA在常规基因治疗中的研究。

孤啡肽OFQ的溶液构象研究

应用近代NMR波谱技术对孤啡肽OFQ及其片段OFQ_(8-17)的溶液结构进行了比较研究,测定了孤啡肽OFQ和片段OFQ_(8-17)在H_2O和TFE/H_2O两种溶剂条件下的2D-DQF-COSY,2D-TOCSY,2D-NOESY(ROESY)谱,完成了它们氨基酸残基的自旋系统识别和序列特异性归属,获得分子中质子化学位移的完全归属,根据NOE特征和主链偶合常数等结构参数确定了它们的特征二级结构,以NOE提供的距离约束,进行了距离几何,分子力学和分子动力学模拟,得到了孤啡肽OFQ在不同溶剂条件下的溶液结构.在H_2O溶剂中,孤啡肽OFQ在G3-F4-T5-G6处形成一复合型转角结构.在TFE/H_2O溶剂中,OFQ整个分子形成两亲性α-螺旋结构.而孤啡肽片段OFQ_(8-17)在这两种环境中均为伸展的无规结构.孤啡肽OFQ在类似膜环境(TFE/H_2O)下的α-螺旋结构可能为其活性构象.

蛋白质磁共振——从结构生物学到结构基因组学

在后基因组时代,随着大量物种全基因组序列的获得,结构生物学家面临着结构基因组学的新机遇和挑战。与传统的结构生物学不同的是,结构基因组学的研究主要集中在结构和功能未知并且与从前研究的蛋白质相似性很小的蛋白质。准确的来讲,结构基因组学通过高通量蛋白质表达、结构解析来完成所有蛋白质家族的结构表征,从而能够通过结构预测功能。加州结构基因组学联合实验室发展了高度自动化的蛋白质合成、结晶、结构解析生产线。然而由于一些蛋白质不能被结晶,要想覆盖所有蛋白质结构域还有很大困难。Wuthrich的研究小组通过一些高通量的目的蛋白质筛选和NMR结构解析的方法解决了这一难题。与X射线晶体学解析蛋白质结构相比,NMR技术由于能够解析更接近生理状态的溶液结构而具有互补性。通过获得溶液中的蛋白质稳定性、动力学特征和相互作用信息,正如在朊蛋白和SARS相关蛋白的研究中所表现的那样,NMR技术从扩大已知的蛋白质结构数据库、新的蛋白质功能到化学生物学研究中都扮演着激动人心的角色。

尿路上皮癌Survivin的表达及其临床意义

目的：探讨Survivin在尿路上皮肿瘤的表达情况及其与肿瘤分期、分级和复发的关系。方法：38例尿路上皮癌患者均有明确的病理学诊断。免疫组织化学染色方法按照试剂盒步骤进行，出现棕黄色胞质和（或）胞核染色区域为阳性，染色强度分为0、1、2、3分，计算表达指数，即染色强度评分×阳性细胞所占比例。结果：Survivin在尿路上皮癌表达的总阳性率为76．3％（29／38），8例正常膀胱粘膜均为Survivin阴性染色。癌组织Survivin的表达指数（1．131＋0．915）明显高于非癌组织（P〈0．001）。Survivin在T0／T1期肿瘤和T2-T4期肿瘤的表达指数分别为1．199±0．943和1．243±0．937，但统计学未见相关性（P=0．633）。Survivin在G1／G2级肿瘤和G，级肿瘤的表达指数分别为1．070±0．952和1．249±0．828，统计学亦未见相关性（P=0．569）。所有患者平均随访25个月，总复发率18．4％，其中Survivin阳性的肿瘤复发率20．7％（6／29），Survivin阴性的肿瘤复发率11．1％（1／9），但两者的差别并无显著性意义（Fisher=0．411）。结论：Survivin在尿路上皮癌组织中表达明显高于非癌组织，表明其在尿路上皮癌的发生、发展中占有重要作用；Survivin有可能成为尿路上皮癌的标志分子，具有潜在的临床诊断价值；Survivin表达与尿路上皮癌分期、分级可能无关，预测复发的价值尚不确定。

左旋多巴和多巴胺对多巴胺转运体数量和功能的影响

目的 :了解左旋多巴和多巴胺对多巴胺转运体的影响。 方法 :通过体外永久表达大鼠多巴胺转运体(DAT)的CHO细胞 (CHO/DAT ,即D8细胞 )的培养 ,采用MTT细胞活性检测和流式细胞仪观察不同剂量左旋多巴和多巴胺对D8细胞的毒性作用 ;利用 [3H]WIN35 ,4 2 8结合率和 [3H]DA摄取率检测DAT的数量和功能。 结果 :左旋多巴和多巴胺不仅对D8细胞有毒性损害 ,呈剂量、时间依赖 (P <0 .0 1) ,还能使DAT数量明显减少 ,与剂量相关 (P <0 .0 1) ,一定剂量的左旋多巴 (2 0 0 μmol/L～ 1mmol/L)可增加细胞对 [3H]DA的摄取 ,而大剂量左旋多巴 (5mmol/L)则抑制DAT的功能 (P <0 .0 1)。左旋多巴和多巴胺呈剂量依赖性地促进细胞凋亡 (P <0 .0 1)。结论 :左旋多巴和多巴胺不仅对D8细胞有毒性损害 ,还能使DAT数量明显减少 ,DAT结合位点的减少比细胞活性的下降更明显。一定剂量左旋多巴可增强DAT的功能。

含胞嘧啶脱氨酶基因的靶向腺病毒载体的构建及应用

目的 建立癌胚抗原 (CEA )启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶基因 (CD )自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,使CD基因只能在CEA阳性的细胞中表达。方法 采用同源重组法在人胚肾细胞株 2 93细胞中重组腺病毒 ,用点杂交、PCR法进行鉴定 ,并进行纯化和滴度测定 ,分别感染CEA阳性和CEA阴性的细胞 ,采用MTT法检测感染细胞对 5 Fc的敏感性。结果 重组腺病毒中含有CEA基因及CD基因 ,纯化后滴度可以达到 5 .0× 10 11pfu/ml ,CEA阴性的Hela细胞感染AdCMVCD后对 5 Fc很敏感 ,而感染AdCEACD后不能被 5 Fc杀伤 ,与之相反 ,CEA阳性的Lovo细胞感染AdCMVCD和AdCEACD后有相似的表达活性 ,均对5 Fc敏感。AdCEACD/ 5 Fc系统有明显的“旁观者”效应。结论 本实验建立的CEA启动子驱动的含CD自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,能使CD基因专一性地在CEA阳性细胞中表达 ,有助于对CEA阳性的肿瘤细胞靶向性自杀基因治疗。

形成素结合蛋白C-端FF结构域的~1H和^(15)N NMR谱峰归属和结构分析

FF结构域广泛存在于与信号传导相关的蛋白质中,我们选择形成素结合蛋白11(forminbindingprotein11,FBP11)中所含的一个FF结构域,通过在H2O和D2O中采集的COSY,TOCSY,NOESY等二维核磁共振谱,识别了FF结构域的氨基酸残基的质子自旋系统,通过解析二维和三维NOESY谱中的dαN、dNN和dβN等NOE相关完成了序列专一性归属;二级结构分析表明FF结构域包含三段α螺旋.