导数分光光度法原理及其在临床生化方面的应用

导数分光光度法(Derivative Spectrophotometry),或称微分光谱法(Differential Spectrophotometry),是分光光度法的重要进展。虽然在50年代已由Hammond和Price二人提出,但直到70年代随着计算机与分光光度计的结合,才有了较快的发展。目前应用较多的领域是石油化工相药品分析方面。

电针刺激对心脏手术病人心肌热休克蛋白mRNA基因表达的影响

观察电针刺激对心脏手术病人心肌细胞热休克蛋白mRNA基因表达的影响。 2 8例ASD病人 ,随机分为针麻组 (组Ⅰ ,n =6 ) ,针刺加全麻组 (组Ⅱ ,n =10 ) ,和全麻组 (组Ⅲ ,n =9) ,于转流前 10min ,停转流 ,停转流 30min ,停转流 1h测定CK MB。结果 :① 3组病人停转流和转流后1hCK MB均较转流前明显增加 ,但组Ⅲ的升幅明显高于组Ⅰ和组Ⅱ ;②针刺组HSP70 mRNA表达高于对照组 (P <0 0 5)。因此针刺有增加缺血心肌细胞HSP70

非霍奇金淋巴瘤的IgH和TCRδ基因重排

目的 :探讨非霍奇金淋巴瘤 (NHL)免疫球蛋白重链 (IgH)和T细胞受体δ链 (TCRδ)基因重排情况。 方法 :用半重叠式聚合酶链反应 (PCR)方法检测IgH及TCRδ基因重排。 结果 :5 7例NHL中 4 1例 (72 % )发生IgH基因重排 ,30例 (5 3% )出现TCRδ基因重排。结论 :检测克隆性基因重排可以作为诊断NHL有效基因标志 。

用多聚酶链反应诊断弓形虫病

根据本实验室筛选出的弓形虫(ZS_2株)特异DNA克隆片段的部分顺序分析的数据,设计并合成特异的寡核苷酸引物对,建立多聚酶链反应诊断弓形虫病的方法。不同来源的弓形虫株和7例畸形胎儿DNA经体外基因扩增,扩增产物经电泳检测,均出现特异的扩增条带。对42例肝炎综合症的婴儿和33例不良生育史的孕妇的外周血白细胞DNA检测,分别为6例和4例阳性。50例正常人外周血白细胞DNA检测均为阴性。对扩增产物进行Southern印迹分析,以^(32)P标记克隆的弓形虫特异DNA片段为探针,能与阳性病例特异的扩增条带杂交,而不与阴性样品的扩增产物杂交。本法并与其它检测方法的结果相比较,具高度特异、敏感且快速的优点。

转化生长因子-β刺激人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子的表达

目的:探讨转化生长因子-β(TGF-β)对人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法:应用逆转录-聚合酶链反应(RTP-CR)和蛋白印迹技术,观察TGF-β1对人近端肾小管上皮细胞(HK-2)α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CTGFmRNA及其蛋白质表达的影响,同时观察肾小管上皮细胞形态改变。结果:HK2细胞有基础量的CTGFmRNA和蛋白质分子表达,在TGF-β1刺激下,其表达量显著增加,经不同浓度TGF-β1干预24h后,CTGFmRNA表达量明显升高,且呈剂量依赖性。1ng/mlTGF-β1刺激时,CTGFmRNA表达量开始显著增加,5ng/ml时达到高峰,10ng/ml时略有下降,CTGFmRNA表达量分别为对照组的2.40倍,3.34倍和2.73倍(P<0.05)。CTGFmRNA表达量呈时间依赖效应。TGF-β1(5ng/ml)干预30min后,CTGFmRNA表达量开始呈现增加趋势,为对照组的1.48倍(P>0.05),2h后出现显著差异,为对照组的2.14倍(P<0.05);CTGFmRNA表达量在24h达到高峰,持续至36h,分别为对照组的3.19倍和2.75倍(P<0.005);0.5ng/mlTGF-β1刺激时,CTGF蛋白表达量略有增加,5ng/ml时达到高峰,10ng/ml时略有下降。在TGF-β1(5ng/ml)干预下,HK2细胞由立方形铺路石样逐渐转变为长梭形长条样,免疫荧光检测见梭形细胞胞浆中有大量αSMA表达。大部分细胞转分化的时间(72h)明显晚于CTGFmRNA?

医学生物化学实验课改革的探索

鉴于生命科学新理论、新技术的发展 ,进行了医学生物化学实验教学改革 ,改编了实验指导书 ,改进了实验教学方法 ,并提出了开设综合性实验的构想。

脂质体介导mIL-12基因与MHCⅠ基因联合对小鼠实验性肝癌的治疗作用

背景与目的:白细胞介素-12及MHCⅠ基因均已单独用于肿瘤基因治疗。为探索两者的抗肿瘤协同效应,本研究探讨小鼠白细胞介素-12(mIL-12)基因与同种异型的MHCⅠ(小鼠为H-2K)基因联合治疗Balb/C小鼠实验性肝癌。方法:分别应用含mIL-12基因、C57BL/6小鼠H-2KbcDNA及绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达质粒载体pcDNA3,体外经新型脂质体LipofectAMINE2000(LF2000)介导转染小鼠肝癌细胞株MM45T.Li,检测转染细胞外源基因的表达。将经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,注射于小鼠皮下,观察致瘤性的变化。在荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射上述脂质体-DNA复合物,观察瘤体生长情况及小鼠生存期的改变。结果:LF2000介导pcDNA3/GFP转染MM45T.Li细胞的最佳条件为脂质体与DNA为3∶1(μg∶μg),转染效率达30%。经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,RT-PCR检测有mIL-12和H-2KbcDNA的特异扩增片段,WesternBlot检测显示有57kDaH-2Kb蛋白表达,ELISA检测mIL-12分泌量达48ng/ml/106细胞。经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,其致瘤性下降;荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射该脂质体-DNA复合物,FACS检测显示小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+、CD4+和CD8+的数量治疗组较对照组高,?

弓形虫感染对围产儿致畸致病的影响

本文报告用免疫学和分子生物学方法对28例畸形儿产妇,10例畸形儿及其母亲,75例婴儿肝炎综合征进行弓形虫检测。23例产妇血清弓形虫抗体阳性率48%,10例畸形儿母亲血清抗体阳性率90%,而畸形儿弓形虫DNA杂交及动物接种分离弓形虫阳性率分别为70%和80%。婴儿肝炎综合征血清抗体阳性率9.8%,上述阳性率均显著高于正常人群弓形虫血清抗体阳性率。说明弓形虫感染是导致胎儿致畸及婴儿肝炎综合征的重要病原之一。

中国人群MHC—Ⅱ类抗原DR4基因体外扩增定型分析及其与类风湿关节炎相关性的研究

本工作拟建立一种 HLA 基因组 DNA 定型方法,采用聚合酶链反应技术对所要分析的 HLA—Ⅱ DR4基因进行体外扩增,并配合等位基因特异性寡核苷酸探针对扩增产物进行分析,以确定个体是否带有该型等位基因.我们用该方法对上海地区52例正常人及32例类风湿关节炎病人 DR4基因进行了分析,结果显示正常人 DR4基因携带者为17.3%,而类风湿关节炎病人高达43.8%(RR=3.7,P<0.01),DR4阳性的病人多为重症活动者(X^2=11.7,P<0.005).此外,我们将该方法与血清学定型方法进行了比较.

^(60)Co辐射后IL-2基因修饰肿瘤细胞生物学行为的改变

目的研究IL - 2基因修饰人肿瘤细胞生物学行为是否因辐射而发生变化。 方法分别从细胞形态结构、MHC分子表达、整合的基因IL - 2基因是否丢失、能否保持mRNA表达、能否分泌表达生物活性的IL - 2等方面进行了实验。结果未见整合的IL - 2基因丢失 ,能表达IL - 2mRNA且在一定时间内持续分泌具有生物活性的IL - 2 ;细胞膜表面MHC分子无明显改变 ;细胞形态结构无明显变化。结论经60 Co辐射修饰的肿瘤细胞致瘤性消失 ,但在一定时间内能分泌IL - 2 ,这为开展基因工程“瘤苗”的临床应用提供了依据。

大鼠浅Ⅱ度烧伤渗液细胞原位杂交生长因子mRNA表达

作者采用大鼠浅Ⅱ度烧伤模型，以DIG标记3’末端寡核苷酸探针对烧伤后皮肤渗出液中的单核－巨噬细胞作mRNA表达的原位杂交，观察3种生长因子在烧伤愈合过程中mRNA表达的变化，反映其在愈合过程中的作用。结果：PDGFmRNA在第3d有一个表达高峰；TGF－αmRNA从6h始表达量逐渐增加，高峰出现在第10d；TGF－βmRNA在第7d出现表达高峰。结论：DIG原位杂交法对检测单个细胞内生长因子mRNA表达是一个比较好的方法，可以定量、灵敏无损伤地观察细胞生长因子基因的激活与表达，认识生长因子在烧伤愈合中的作用。

不同年龄组人红细胞内ATP含量

本文用萤光素－萤光素酶生物发光法测定了不同年龄组人红细胞内ＡＴＰ含量，发现老年组和脐血组红细胞内ＡＴＰ含量分别为１．５５±０．２８ｍｍｏｌ·Ｌ^（－１）ＲＢＣ和１．５６±０．２５ｍｍｏｌ·Ｌ^（－１）ＲＢＣ，中年组和青年组红细胞内ＡＴＰ含量分别为１．４５±０．１２ｍｍｏｌ·Ｌ^（－１）ＲＢＣ和１．４２±０．１２ｍｍｏｌ·Ｌ^（－１）ＲＢＣ，老年组和脐血组红细胞内ＡＴＰ含量明显高于中青年组。

阳离子脂质体介导细胞因子基因对小鼠肝癌抑制的作用

目的观察阳离子脂质体介导细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２基因对小鼠肝癌的抑制作用。方法构建含细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２的质粒载体，用阳离子脂质体ＬｉｐｏｆeｃｔＡＭＩＮＥ或ＤＯＳＰＥＲ介导的含细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２的质粒ＤＮＡ分别体外转染小鼠肝癌细胞株ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ，并在荷瘤小鼠体内分别直接注射上述阳离子脂质体－ＤＮＡ复合物，观察瘤体大小及小鼠生存期。结果两种阳离子脂质体介导的细胞因子转染后都具有生物学活性，转染效率为１０％左右，瘤内注射后均能延长荷瘤小鼠的生存期。ＤＯＳＰＥＲ介导细胞因子的治疗效果较佳。结论ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ或ＤＯＳＰＥＲ介导细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２基因均具有抑制小鼠肝癌生长、延长荷瘤小鼠生存期的作用，ＤＯＳＰＥＲ的效果较好。

P选择素在肾小球肾炎、肾癌中的表达及意义

探讨肾小球肾炎和肾癌患者肾组织中P选择素的表达与疾病的关系。方法：采用免疫组化和原位杂交技术检测了133例肾小球肾炎、20例肾癌患者肾组织中P选择素的表达。结果：P选择素在肾小球肾炎患者的肾小管阳性表达率明显高于肾小球和肾间质；在肾小球表达，Ⅱ组（肾小球内细胞明显增生）显著高于Ⅰ组（肾小球炎症轻微）和Ⅲ组（肾小球硬化为主的晚期病变）；肾小管间质病变程度与肾小管、肾间质P选择素表达明显相关。在肾癌中，P选择素阳性表达率为55．5％，而晚期肾癌（Ⅲ、Ⅳ期）阳性表达率87．5％明显高于早期肾癌（Ⅰ、Ⅱ期）的33．3％。结论：结果提示P选择素是人类增生性肾小球肾炎早期发病的重要参与因素，并与患者肾小管间质病变程度密切相关。此外，其与肾癌浸润转移有关，并可能是一种新的肾癌转移及预后指标。

黄芪促进高糖环境下肾间质成纤维细胞表达肝细胞生长因子的作用

目的体外研究高糖刺激人肾脏间质成纤维细胞时肝细胞生长因子(HGF)表达,同时进一步观测了黄芪延缓糖尿病肾病进展是否与影响 HGF 表达相关。方法将人肾脏间质成纤维细胞培养于不同浓度葡萄糖中,分不同时间段采用 RT-PCR 方法检测 HGF mRNA 转录水平,ELISA 方法检测 HGF 蛋白分泌。之后用黄芪含药血清刺激细胞,观察 HGF 表达情况。结果高浓度葡萄糖培养的细胞早期就有 HGF 表达,之后表达逐渐下降。说明 HGF 表达与高糖作用存在相关性。结果进一步证实,黄芪含药血清可以显著刺激细胞表达 HGF。结论黄芪可以通过诱导 HGF 的产生,起到抗纤维化作用,从而延缓糖尿病肾病的进展。

HLA－DRB1基因位点多态性的PCR－RFLP分析

设计并建立一套适合国内应用的改良ＰＣＲ－ＲＦＬＲ方法，分５组特异性扩增ＤＮＡ样品，随后进行酶切定型分析，准确检测了编码ＤＲ抗原特异性的ＨＬＡ－ＤＲＢ１基因位点的多态性，该法采用分组扩增，不发生与其它ＤＲＢ位点等位基因的交叉扩增，不仅适合纯合子的区分而且可以清楚准确地检测杂合子样品，已报道过的ＤＲＢ１位点编码的特异性组合都可以通过这个方法得到准确分析。所使用的Ⅱ类限制性内切酶均价格便宜、易购。

大鼠Ⅲ度烧伤混合植皮愈合时生长因子mRNA表达的研究

目的：为了探索大面积Ⅲ度烧伤混合植皮创面愈合过程中生长因子的作用。方法：本实验以大鼠为模型，在异体皮移植后３、５、７、１４、２１和２８天以及自体皮移植后２、４、１１、１８和２５天分别取自体皮区、异体皮区皮肤，用酸性硫氰酸胍苯酚氯仿（ＡＧＰＣ）法提取总ＲＮＡ，经逆转录聚合酶链反应（ＰＴＰＣＲ），测定ＴＧＦα、ＴＧＦβ１、ＰＤＧＦ和ｂＦＧＦ的ｍＲＮＡ表达量。结果：１）这四种生长因子ｍＲＮＡ表达在自体皮区及异体皮区各时相都能被检测到，并且自体皮区表达均高于异体皮区。２）在自体皮区，ＴＧＦα的表达在２大以后持续升高，表达峰值在１８天；ＴＧＦβ１在２天就有高表达，第二峰值出现在１８天；ＰＤＧＦ在２天有较高表达，表达峰值在４天，随后逐渐下降，２５天回升：ｂＦＧＦ也在２天有很高表达，以后下降，象ＰＤＧＦ一样，２５天回升。３）在异体皮区，创面愈合早期这四种生长因子表达都较低，以后各有不同程度升高。结论：１）移植的自体皮与异体皮都存活，并反映了自体皮区的愈合再生较异体皮区旺盛。２）在自体皮区这四种生长因子通过自分泌作用，旁分泌作用，到达创伤区，沿着信号转导通路，相互协同发挥效应，促进创面愈合。３）在异体皮区存在排异反应，?

血液透析患者外周血单个核细胞细胞因子基因表达RT-PCR定量方法的建立

血液透析(血透)时,外周血单个核细胞被激活,表达和(或)分泌不同细胞因子,如 IL-1β、TNF-α、IL-6等,这可能与临床急、慢性血透并发症的发生有关。

复制缺陷型腺病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在体内外的高效转移和表达

为了构建含人凝血因子Ⅷ基因的重组腺病毒载体系统，首先构建了含ＦⅧ（Ｂ结构域缺失型）的载体质粒ｐＡｄ－ｈＦⅧ和插入内含子结构的ｐＡｄＩ－ｈＦⅧ，经脂质体介导，证明两质粒的目的基因均能在ＣＯＳ－７细胞中表达有凝血活性的ＦⅧ因子，其中经纯化的载体质粒ｐＡｄ－ｈＦⅧ与ｐＢＨＧ１０经脂质体介导，共转染至２９３包装细胞，经同源重组和Ｅ１蛋白反式互补，形成Ｅ１／Ｅ３缺失型重组腺病毒载体颗粒Ａｄ－ｈＦⅧ．ＰＣＲ检则到病理２９３培养液上清的病毒ＤＮＡ中具有目的基因扩增片段，证明病毒ＤＮＡ含有ＦⅧ基因．经扩增、纯化、滴度测定，用于感染离体细胞ＣＯＳ－７、Ａ５４９、Ｌ９２９、２９３．证实该病毒能在上述细胞中高效转移和表达目的基因，其表达量具有一定范围内的剂量依赖性．ＣＯＳ－７细胞中，ＭＯＩ＞１０００时，有细胞毒效应，表达量反而下降．经耳缘静脉注射Ａｄ－ｈＦⅧ至家兔后，１～４周能测到一定水平的ＦⅧ蛋白，１周内升至最高峰．免疫组化研究表明感染的离体细胞和家兔肝等组织均有ＦⅧ表达，其中肝脏表达最高．

转铁蛋白增强脂质体介导基因对肝癌细胞的转染和表达

目的：检测转铁蛋白能否增强脂持体介导外源基因对肝癌细胞的转染和表达。方法：应用本滓验室构建的含小 鼠一细胞介素（ｍｌＬ）－１２的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３ ｍＩＬ－１２和绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ ＥＧＦＰ， 观察转铁蛋白增强阳离子脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导上述两种质粒ＤＮＡ对小鼠和不同人肝癌细胞株的转染及 表达效率。结果：ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ加转铁蛋白介导ｐｃＤＮＡ３／ＥＧＲＰ对小鼠肝癌细胞株Ｈｅｐｌ－６的转染效率由２％－ ５％提高至２０％，对４种不同人肝癌细胞株的转染效率由１５％。提高至６５％～７５％；但对小鼠肝癌细胞株ＭＭ４５ＴＬｉ 的转染效率并不增加。转铁蛋白可使ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导ｐｃＤＮＡ３ｍＩＬ－１２在Ｈｅｐｌ－６中的表达量增强１８倍。结论： 转铁蛋白能够与ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ和质粒ＤＮＡ形成复合物，显著增强脂质体介导外源基因对肝癌细胞的转染和表 达，但对不同种肝癌细肥株的增强效率不同。