JNK信号转导通路在Aβ_(25-35)诱导大鼠原代海马神经元凋亡中作用机制的研究

目的 研究Aβ2 5 35诱导海马神经元凋亡的机制以及JNK抑制剂SP6 0 0 12 5的保护作用 ,探讨在Aβ2 5 35细胞毒性中JNK c Jun信号转导通路的可能作用机制。方法 将体外海马原代神经元培养至第 7天 ,用 β淀粉样蛋白2 5 35片段 (Aβ2 5 35)和JNK抑制剂 (SP6 0 0 12 5 )对细胞进行处理。用光镜进行海马原代神经元形态学观察 ,MTT检测不同时间点的细胞活性 ,以及用免疫印迹法检测不同时间点的JNK及c Jun蛋白活性。结果 大鼠原代海马神经元经过Aβ2 5 35处理后 ,发生凋亡 ,细胞生存率呈时间依赖性下降 ,经过免疫学方法检测发现细胞在Aβ2 5 35处理早期出现磷酸化JNK和磷酸化c Jun的表达增高 ,且这一过程可被SP6 0 0 12 5抑制。MTT检测发现在使用SP6 0 0 12 5后 ,细胞生存率上升 ,具有显著性差异。 结论 体外原代海马神经元培养实验表明Aβ2 5 35在诱导原代海马神经元凋亡过程中 ,c Jun氨基端激酶 (JNK)及其底物转录因子c Jun被激活。使用JNK抑制剂SP6 0 0 12 5后 ,JNK和c Jun均被抑制 ,且海马原代神经元的生存率明显提高 ,生存状态明显改善。研究表明JNK信号转导通路可能促成Aβ的细胞毒性作用。

Neurturin基因的克隆及其在C17.2神经干细胞中表达的研究

目的 探讨Neurturin(NTN)基因转染的C17.2神经干细胞移植后对帕金森病(PD)大鼠模型的保护作用,为其提供基因修饰的神经干细胞。方法 用 RT-PCR方法获取Prepro-NTN cDNA,并克隆至 pBlueskiptⅡ载体中,再将 Prepro-NTN基因克隆至 pcDNA3.1-hygro真核表达载体中,经 Lipofectamine 2000转染 C17.2神经干细胞,挑选稳定表达的克隆,用 RT-PCR及 Western Blot印迹分析鉴定。结果 pcDNA3.1-hygro-NTN质粒转染C17.2神经干细胞后有5个稳定表达的克隆生长,克隆1有NTN蛋白的高表达。结论 获得了稳定表达NTN蛋白的C17.2神经干细胞克隆,为移植治疗PD打下了坚实的实验基础。

成年大鼠骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞不同方法比较的研究

目的 研究成年大鼠骨髓基质干细胞 (BMSCs)诱导分化为神经元样细胞不同的方法 ,寻找它向神经细胞分化的最佳条件。 方法 取纯度较高的BMSCs,通过不同的神经营养因子诱导法和抗氧化剂诱导法 ,进行抗巢蛋白 (nestin)、神经元特异烯醇化酶 (NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、酪氨酸羟化酶 (TH)免疫细胞化学染色 ,观察相应的阳性细胞数。结果 诱导第 3天A组 (EGF :表皮生长因子 ,bFGF :碱性成纤维细胞生长因子 ,RA :全反式维甲酸 ) ,B组 (GDNF :胶质细胞系源性神经营养因子 ,BDNF :脑源性神经营养因子 ) ,C组 (EGF ,bFGF ,GDNF ,BDNF和RA)的Nestin阳性细胞数较多 ,其中以C组最多 ,而D组 (抗氧化剂 )Nestin阳性细胞数少于前三组。A ,B ,C组的NSE ,GFAP染色阳性细胞数较D组少 ,但D组有部分细胞发生死亡。诱导第 7天A ,B ,C组的NSE ,GFAP阳性细胞数较第 3天时明显增多 ,C组最多 ,B组其次 ,Nestin阳性细胞数比例较第 3天时明显减少。而D组的NSE ,GFAP阳性细胞数少于其第 3天时 ;C组诱导成神经细胞比例较高 ,阴性对照组和空白对照组极少或无阳性细胞。此外 ,神经营养因子诱导法生成神经样细胞的比例都多于胶质样细胞。 结论 抗氧化剂诱导法分化诱导快 ,而神经营养因子诱导法分化诱导效率高 。

大鼠骨髓基质细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的研究

目的研究骨髓基质细胞(BMSCs)能否分泌胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)及其分泌规律,为进一步探讨BMSCs治疗帕金森病(PD)大鼠模型的作用机制提供实验依据。方法取较高纯度的BMSCs进行培养,通过RT-PCR和ELISA法,分别从mRNA和细胞蛋白水平测定体外培养BMSCs的上清液和细胞蛋白中GDNF的含量。结果通过RTPCR法检测结果显示在mRNA水平,BMSCs中有GDNF的表达。在蛋白水平,采用ELISA法在培养第3天以后的培养液和细胞蛋白中均可检测到GDNF,并随着时间的延长,培养液和细胞蛋白中GDNF浓度明显升高。结论BMSCs具有分泌GDNF的能力,细胞分泌可能受周围环境和自身生长状况的影响,其分泌是非持续性的。GDNF浓度的升高不仅与BMSCs细胞数量增加有关,还与细胞本身分泌能力的增强有关。

咪多吡拮抗MPTP诱致小鼠黑质神经元凋亡的实验研究

目的 探讨 ＭＰＴＰ和ＭＰＰ＋对黑质多巴胺能神经元和 ＰＣ１２细胞的凋亡作用以及咪多吡（Ｅｌｄｅｄ）的保护作用。方法应用ＭＰＴＰ腹腔注射Ｃ５７ＢＬ小鼠及口服Ｅｌｄｅｐｒｙｌ预处理，分别用ＴＵＮＥＬ法和ＦＡＣＳ法对黑质神经元进行凋亡检测；体外实验用同样的方法对分别加入ＭＰＰ＋或 ＭＰＴＰ的 ＰＣ１２细胞进行凋亡检测。结果 ＭＰＩＰ ３０ｍｇ／ｋｇ连续注射７天能诱致黑质神经元凋亡，Ｅｌｄｅｐｒｙｌ预处理能完全拮抗ＭＰＴＰ诱致黑质神经元凋亡；ＭＰＰ＋能使ＰＣ１２细胞发生凋亡，而ＭＰＴＰ则不能导致凋亡。结论ＭＰＴＰ可能通过细胞凋亡机制导致黑质神经元死亡，其凋亡作用是通过ＭＰＴＰ代谢转化为ＭＰＰ＋而实现的，Ｅｌｄｅｐｒｙｌ能抑制ＭＰＴＰ向ＭＰＰ＋的转化，从而有效地拮抗ＭＰＴＰ诱致黑质神经元凋亡。

Nurr1基因的克隆及其在C17.2神经干细胞中的表达

目的 :通过克隆Nurr1基因并在神经干细胞中表达 ,探讨其对多巴胺能神经元生长、发育的影响 ,为治疗神经系统变性疾病 ,特别是帕金森病提供基因工程细胞。 方法 :采用RT PCR (reversetranscription polymerasechainreaction)方法获取Nurr1cDNA ,并克隆至pcDNA3.1 hygro载体中 ,经酶切及测序鉴定正确 ;再将Nurr1基因经Lipofectamine2 0 0 0转染 ,在C17.2神经干细胞中稳定表达。结果 :经反转录多聚酶链反应 (RT PCR)及WesternBlot印迹分析、鉴定Nurr1基因mRNA及蛋白表达正确。 结论 :Nurr1基因成功导入神经干细胞并表达 ,为实施基因工程细胞移植治疗PD奠定了基础。

左旋多巴对C17.2神经干细胞的毒性作用及司来吉兰的神经保护作用

目的 探讨左旋多巴对C17.2神经干细胞的毒性作用和司来吉兰对其的拮抗作用。 方法 采用MTT法检测不同剂量左旋多巴对C17.2神经干细胞的毒性作用 ,用Brdu标记检测左旋多巴对细胞增殖的影响 ,用透射电镜、Annexin V染色荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡 ,用WesternBlot检测Caspase3及其活性片段 ;相同条件下同时检测司来吉兰的保护作用。结果 MTT显示左旋多巴可使C17.2神经干细胞活性降低 ,与剂量相关 (P <0 .0 5 ) ,Brdu标记显示 2 0 0 μmol/L左旋多巴可使细胞增殖活力下降 ,与时间相关 (P <0 .0 5 ) ,作用 12及 2 4h后的透射电镜、Annexin V染色荧光显微镜和流式细胞仪可检测到凋亡细胞 ,WesternBlot显示Caspase 3表达量增加 ,并逐渐被切割成活性片段。司来吉兰能部分保护细胞免受左旋多巴的影响 (P <0 .0 5 ) ,并能部分抑制左旋多巴引起的细胞凋亡 (P <0 .0 5 )。 结论 大剂量左旋多巴对C17.2神经干细胞具有毒性作用 ,呈剂量和时间依赖性。毒性剂量的左旋多巴可通过抑制DNA合成影响细胞增殖 ,并通过活化Caspases 3促进细胞凋亡 ,司来吉兰可部分拮抗上述作用。

脂多糖对多巴胺能神经元的损毁作用及其机制研究

目的观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的损毁作用,探讨免疫机制与帕金森病(Parkinson disease,PD)发病的相关性.方法采用立体定向术将LPS注入大鼠单侧黑质后分别于注射后2、3、4周经腹腔注射阿朴吗啡诱发动物旋转行为;采用高效液相色谱-电化学法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定纹状体和黑质部位DA等单胺类递质含量;采用免疫组化法检测黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞数;采用尼(氏)染色(Nissl)观察小胶质细胞的活化和以双重免疫酶染色法观察小胶质细胞活化和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide,iNOS)合成.结果大鼠单侧黑质注入LPS后2、3、4周,以阿朴吗啡诱发大鼠均出现旋转行为,其损伤侧纹状体和黑质DA及其代谢物含量降低了30%～70%,注射侧的黑质TH阳性细胞数减少,尤以3周和4周为甚,尼(氏)染色和双重免疫酶染色法也分别显示LPS注射侧小胶质细胞活化,同时伴有iNOS合成的增加.结论 LPS对DA能神经元具有一定的损毁作用,小胶质细胞的活化及其释放的NO有可能参与该细胞死亡,提示免疫机制与PD的发病可能存在相关性.

NF-κB在NGF和TNF-α对Aβ_(25～35)海马神经细胞毒的保护作用中的机制研究

目的研究神经生长因子(NGF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对β-淀粉样蛋白25～35(Aβ25～35)诱导海马神经细胞凋亡的保护作用,探讨核转录因子-κB(nucleartranscriptionfactor,NF-κB)在此过程中的可能机制。方法通过体外SD大鼠海马原代细胞培养,采用TUNEL和AnnexinV染色法观察Aβ25-35诱导的细胞凋亡;采用MTT法观察细胞存活率,以及采用WesternBlot法检测NF-κBp65蛋白的表达。结果大鼠海马神经细胞经Aβ25～3510mg/L孵育48h后,TUNEL染色显示神经细胞核多呈绿色荧光着色,提示细胞凋亡,而对照组未见荧光着色;AnnexinV染色海马神经细胞膜亦多呈绿色荧光着色,但细胞核未着色,对照组则无荧光着色。MTT检测显示,NGF组和TNF-α组神经细胞存活率均较Aβ组明显增加(P<0.05);经NF-κB抑制剂SN50预处理后,NGF组和TNF-α组神经细胞存活率与Aβ组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。WesternBlot法检测显示,NGF组和TNF-α组的海马神经细胞NF-κBp65蛋白表达明显增加。当NGF和TNF-α的浓度为10μg/L时,均对Aβ25～35的海马神经细胞毒具有保护作用。经NGF和TNF-α处理后,NF-κB活性增加;当给予18mol/LSN50抑制NF-κB活性后,NGF和TNF-α对海马神经细胞的保护作用减弱(P>0.05)。结论体外原代海马神经细胞培养结果表明。

神经干细胞治疗脑缺血损伤

目前发现神经干细胞不仅存在于胚胎脑而且亦存在于成年哺乳动物脑内,这些细胞具有补偿和恢复缺血导致的神经功能障碍的作用。干细胞分化依赖于移植微环境,不同组织来源的干细胞可以相互转换。本文就神经干细胞、骨髓细胞移植治疗脑缺血损伤作一综述。

神经变性疾病与泛素蛋白酶体系统

神经变性疾病的病因和发病机制尚不明确,但它们却有着相似的病理特征—细胞内外异常蛋白的聚集。这提示不同的神经变性疾病可能有一个共同的发病机制,即与异常蛋白的形成有关。泛素蛋白酶体系统在处理这些异常蛋白质中起核心作用,故泛素蛋白酶体系统在神经变性疾病发病机制中的作用倍受关注。本文就典型的神经变性疾病与泛素蛋白酶体系统功能障碍之间关系的研究进展做一文献综述。

影响帕金森病患者生活质量的主要因素

目的 探讨影响帕金森病(PD)患者生活质量(QoL)的主要因素。方法 采用PD统一评分量 表第2部分(UPDRS Ⅱ)对97例PD患者的健康相关生活质量(HRQoL)进行评估,同时选用汉密尔顿焦虑量 表(HAMA)、汉密尔顿抑郁量表(HAMD)、简易精神状态量表(MMSE)、PD统一评分量表第1及第3部分 (UPDRS Ⅰ,UPDRS Ⅲ)、Hoehn Yahr分级作为评估患者的焦虑状况、抑郁状况、认知功能、运动障碍程度的主 要指标。结合患者的年龄、起病年龄、性别、病程、左旋多巴累积用量、有无症状波动、有无精神症状等可能影 响QoL的因素评价上述指标对PD患者QoL影响的程度。结果 逐步线性多重回归分析显示:对PD患者 HRQoL(UPDRS Ⅱ分数)影响最大的因素是运动症状(UPDRS Ⅲ)、病程、抑郁程度(HAMD抑郁评分)及有无 精神症状(UPDRS Ⅰ)。上述4项因素相加对UPDRS Ⅱ分数的影响起决定作用的占78.4%。结论 在本次 调查的样本中,心理与躯体因素联合作用影响PD患者的QoL。因此,在诊治过程中应联合治疗心理及躯体疾 患,加强康复锻炼,完善生活辅助用具,以提高PD患者的QoL。

离子通道病研究的现状和展望

离子通道 (ionchannels)在细胞分子水平对维持机体的正常生理功能至关重要。当离子通道由于某些先天性的或后天获得性的原因导致其结构和 (或 )功能发生改变时 ,其所承载的功能必将发生异常 ,从而可能导致离子通道病 (channelopathy)的发生。作为近年新兴的一门交叉型前沿学科 ,目前离子通道病的研究模型和方法日渐完善 ,对于离子通道病的研究不仅为这类疾病的早期诊断和治疗提供了基础 。

左旋多巴对帕金森病大鼠血清兴奋性氨基酸及抗氧化指标的影响

目的 研究左旋多巴对帕金森病 (PD)大鼠血清兴奋性氨基酸含量及部分抗氧化指标的影响。方法 应用 6 羟基多巴胺 (6 OHDA)制备部分和严重损毁的PD大鼠模型 ,给两种模型大鼠连续服用不同剂量左旋多巴 /苄丝肼 3个月 ,利用高压液相色谱 紫外检测仪测定大鼠血清谷氨酸、谷氨酰胺和天门冬氨酸的含量 ,采用生化法测定PD大鼠血清超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽 (GSH)及谷胱甘肽过氧化物酶的水平。结果 左旋多巴可使严重损毁组大鼠的血清天门冬氨酸水平明显升高 (P <0 .0 5 ) ,而谷氨酸、谷氨酰胺水平无明显改变。使用左旋多巴后血清超氧化物歧化酶、丙二醛及谷胱甘肽水平无明显改变 ,而小剂量左旋多巴组大鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶水平显著升高 (P <0 .0 1)。结论 长期使用左旋多巴对PD模型大鼠可能有兴奋毒性作用 。

免疫机制与帕金森病关系的研究

目的 探讨免疫机制与帕金森病 (PD)发病的相关性。方法 采用PD患者的血清IgG建立PD的细胞模型 ,将纯化的PD患者、疾病对照组患者及正常人的血清IgG或 /及补体加入大鼠胚胎中脑神经元 胶质细胞混合培养体系中 ,通过MTT法检测细胞活力 ,免疫细胞化学法评价多巴胺 (DA)能细胞的数目、形态。结果 单独PDIgG(6 0 μg/ml)或补体对原代中脑神经元 胶质细胞混合培养体系中的DA能神经元的数目、形态无明显影响 (P >0 0 5 ) ;当培养体系同时接受二者处理时 ,抗酪氨酸羟化酶 (TH)阳性细胞数明显减少 (P <0 0 1) ,突起明显减少和缩短 ,β tubulin阳性细胞数和形态无明显变化 (P >0 0 5 ) ,总的细胞活力无明显下降(P >0 0 5 ) ,PDIgG(0、2 0、6 0、10 0 μg/ml)依赖补体对DA能神经元的毒性作用呈剂量依赖性。疾病对照组和正常对照组的血清IgG即使在补体存在时对TH阳性细胞数、形态也无明显影响 (P >0 0 5 )。结论 在补体存在时 ,用PDIgG可建立PD的细胞模型 。

成年大鼠脑内ATP敏感性钾通道亚型mRNA表达的研究

为探讨ATP敏感性钾通道(KATP)亚型在大鼠脑组织中的表达,本研究采用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测了大鼠小脑、大脑皮质、海马、纹状体、黑质的KATP亚型mRNA的表达。结果显示Kir6. 1、Kir6. 2、Sur1、Sur2B在小脑、大脑皮质、海马、纹状体、黑质中均有表达,Sur2A在脑组织中未见表达。Kir6. 1mRNA在海马和黑质的相对表达水平明显高于小脑、大脑皮质和纹状体(P<0.01);Kir6. 2和Sur1mRNA在黑质的相对表达水平明显高于小脑、大脑皮质、海马和纹状体 (P<0.01 );Sur2BmRNA在黑质、海马和纹状体的相对表达水平明显高于小脑和大脑皮质(P<0.01 )。以上结果提示KATP在脑内具有广泛表达,其表达水平在不同部位存在着差异性。

施普善在缺血性脑卒中急性期的临床疗效研究

目的评价施普善(Cerebrolysin,脑活素)治疗急性期缺血性卒中的临床有效性和安全性.方法研究对象为经磁共振成像或CT确诊为一侧颈动脉系统的缺血性卒中,且神经功能缺损(NIH)评分在8～22分的患者.施普善组(144例)接受施普善50 ml静脉滴注,共10天;对照组(140例)接受非施普善的常规治疗.结果与对照组比较,施普善组患者NIH评分的改善分值和改善率除在治疗后第3天时无显著差异外,在治疗后第11、21、28天时均有显著差异.两组患者的生活能力状态评分均有改善;与对照组比较,施普善组患者生活能力状态评分的改善分值和改善率在治疗后28天时与对照组均有显著差异.结论施普善能改善急性缺血性脑卒中患者的神经功能缺损,是一种安全有效的药物.