人牙本质涎蛋白的抗体制备和组织表达研究

目的 :制备人牙本质涎蛋白抗体 ,观察其在不同组织的表达情况。方法 :用原核表达并经过初步纯化的人牙本质涎蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗血清并用Westernblot法测定效价和检测牙胚和其它组织的蛋白表达。结果 :抗人牙本质涎蛋白抗血清效价可达 1:10 0 0 0 0 ;Westernblot显示牙本质涎蛋白在人牙胚中有表达 ,其分子量约为Mr6 0× 10 3 左右。结论 :牙本质涎蛋白在人牙胚组织中有表达 ,提示其在牙齿发生、牙本质修复和再矿化中可能起重要作用。

人牙本质涎蛋白在COS-7细胞中的表达

目的 :构建人牙本质涎蛋白 (humandentinsialoprotein ,hDSP)真核表达载体 ,用瞬时系统表达目的基因。方法 :将hDSP全长基因定向克隆入真核表达质粒载体pcDNA3 ,构建pcDNA3 hDSP重组质粒 ,脂质体转染法转染COS 7细胞 ,48～ 72h收集细胞及培养上清 ,Westernblot和免疫组化检测表达产物。结果 :酶切鉴定表明重组表达载体构建成功 ;Westernblot检测显示在 60 0 0 0处出现一条清晰的特异性免疫阳性条带 ;免疫组化染色显示细胞胞质内有大量棕黄色颗粒 ,进一步证明该转染方法可行 ,转染效率较高。结论 :hDSP全长基因可以在COS 7细胞获得瞬时高效表达。

小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区cDNA克隆

目的 :克隆小鼠釉丛蛋白 (tuftelin)成熟肽编码区基因。方法 :设计引物 ,以小鼠牙胚cDNA文库为模板 ,利用PCR方法 ,扩增出小鼠釉丛蛋白成熟区的基因片段 (约 12 0 0bp) ,将所得基因片段插入pBS质粒载体 ,转化到大肠杆菌XL - 1-Blue后挑选阳性克隆 ,提取重组质粒DNA ,通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果 :重组质粒pBS -tuftelin的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论 :克隆到小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区基因。

小鼠成釉蛋白成熟肽编码区cDNA序列的克隆

目的：克隆小鼠成釉蛋白（ＡＭＢＮ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ，然后利用ＰＣＲ方法，从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠成釉蛋白成熟区的基因片段（约１．１ｋｂｐ），将所得基因片段插入ｐＴＺ１８质粒载体，转化到大肠杆菌ＤＨ５α后挑选阳性克隆，提取重组质粒ＤＮＡ，通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒ｐＴＺ－ＡＭＢＮ的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。

人牙本质涎磷蛋白成熟肽cDNA的克隆、序列分析和原核表达

目的 克隆人牙本质涎磷蛋白 (DSPP)成熟肽编码区基因片段并进行原核表达 .方法 用异硫氰酸胍一步法从人牙乳头组织中抽提总 RNA,用 Oligo(dt)作引物逆转录合成牙乳头 c DNA,然后利用 PCR法 ,从 c DNA中扩增出人DSPP成熟肽基因片段 (约 6 0 0 bp) ,将所得基因片段插入p Bluescript质粒载体 ,转化到大肠杆菌 XL 1- Blue后挑选阳性克隆 ,提取重组质粒 DNA,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆 ;将 DSPP基因重组入表达载体 p GEX- 3X中构建表达载体 ,并在大肠杆菌 BL 2 1中进行表达 .结果 酶切图谱和序列分析与国外文献报道一致 ,DSPP蛋白在大肠杆菌中得到表达 .结论 克隆到人 DSPP成熟肽编码区基因片段 ,并在原核中得到表达 ,为进一步研究其功能奠定基础 .

从人软骨提取总RNA和CDMP-1成熟肽片段的克隆

目的克隆人软骨来源形态发生蛋白 - 1(CDMP - 1)成熟肽编码区的基因片段。 方法用异硫氰酸胍一步法从人软骨组织和酶消化法原代培养的软骨细胞中分别抽提总RNA ,利用RT -PCR方法扩增出人CDMP -1成熟区的基因片段 (约 1.0kbp) ,将所得基因片段插入 pBluescript质粒载体 ,重组质粒DNA ,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。 结果从软骨组织直接抽取到总RNA ,其质量与从等重量软骨组织中的原代软骨细胞所抽取的基本一致 ,人CDMP - 1酶切图谱正确 ,测序得到的部分序列与基因库公布序列一致。 结论从软骨组织可以直接抽取总RNA ,克隆到人CDMP - 1成熟肽编码区的基因片段。

小鼠牙本质涎磷蛋白成熟蛋白编码区cDNA克隆与部分序列分析

目的 克隆小鼠牙本质涎磷蛋白 (dentinsialophosphoprotein ,DSPP)成熟蛋白编码区基因。方法 用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总RNA ,用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA ,然后利用PCR方法 ,从cDNA中扩增出小鼠DSPP成熟区的基因片段 (约 3kbp) ,将所得基因片段插入pBluescriptKS质粒载体 ,转化到大肠杆菌XL1 Blue后挑选阳性克隆 ,提取重组质粒DNA ,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果 重组质粒pBS DSPP的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论 克隆到小鼠DSPP成熟编码区基因 ,正在进行该基因的表达和活性鉴定。