免疫性输血反应的调查及预防研究

目的 对各类输血反应进行调查研究 ,同时建立输血前免疫血液学检查新技术 ,以预防和治疗免疫性输血反应。方法 对上海地区 13家医院的 30 776名输血病人进行调查 ,并应用改良Polybrene、简易致敏红细胞血小板血清学试验 (SEPSA)等新技术 ,进行同种特异性抗体的筛选、鉴定及交叉配型试验。结果 发生各类输血反应5 0 8例 (1.6 5 % ) ,其中检出引起免疫性输血反应的同种抗体 6 4例 (12 .6 % ) ,抗体特异性分别为血小板抗体 (包括HLA) 5 1例 ,红细胞不规则抗体 13例 ;各项新技术的应用对预防免疫性输血反应的发生具有显著相关性 (χ2 >3.84 ,P <0 .0 5 )。结论 使用研究建立的输血前免疫血液学新技术能有效地诊断、预防和治疗免疫性输血反应的发生 。

血液中同种抗体的固相化筛查及其对临床输血效果的影响

目的对随机献血者及临床输血患者红细胞、血小板、淋巴细胞与中性粒细胞的抗体进行固相化联合筛查体系。方法将单层混合多人份血细胞分别固定在U型微孔板中,制备出固相化抗体筛查体系。然后对随机献血样本2 150例及临床输血患者输血后样本440例血浆中是否含有相应抗体进行检测,并分析对对输血后效果的影响。结果随机献血者样本中抗体筛出率为:红细胞抗体53例(2.5%),血小板抗体22例(1%),淋巴细胞抗体13例(0.6%),中性粒细胞抗体55例(2.6%);临床输血患者输血后样本中抗体筛出率为:红细胞抗体31例(7%),血小板抗体38例(8.6%),淋巴细胞抗体24例(5.5%),中性粒细胞抗体43例(7.5%),混合抗体(包括同时存在两种或两种以上抗体)115例(26.1%)。223次(22.8%)输血后产生疑似不良反应,其中133例(约60%)检出抗体阳性。结论血细胞抗体固相化筛查体系可应用于临床输血前及输血后抗体检测。固相化检测体系灵敏度高于试管法血清学检测与流式细胞术。抗体的存在对输血效果存在一定的影响。

上海地区汉族人群中性粒细胞抗原的基因频率与其分子特征研究

目的:了解上海地区汉族人群人类中性粒细胞抗原(Human neutrophil antigens,HNA)的基因频率分布与其分子特征。方法:使用序列特异性引物聚合酶链反应(Polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)对上海地区326名随机健康献血者的HNA-1(-a,-b,-c),HNA-3(-a,-b),HNA-4a(+,-)和HNA-5a(+,-)进行基因分型,测序和PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)验证其分子特征;并使用流式细胞术分析另外91份随机健康样本HNA-2a抗原表达。结果:本研究成功分析HNA-1、3-5各系统基因型。发现3例FCGR3B的变异体,其中2例为FCGR3B*01等位基因发生227 A→G和349 G→A的突变,另1例为一条染色体上的FCGR3B*02等位基因发生277 A→G的突变。HNA-1a、1b、1c、3a、3b基因频率分别为0.620、0.380、0、0.653和0.347,HNA-4a(+)、4a(-)、5a(+)、5a(-)基因频率分别为1、0、0.896和0.104,流式结果证实HNA-2a抗原频率为1,所测个体均具有HNA-2a阳性粒细胞,但不同个体具有不同比例的阳性粒细胞。这些分布与高加索人群相比有非常显著的差异,而与广东人群相比,主要是HNA-3系统分布有差异。结论:中国上海人群HNA具有独特的多态性,需要引起输血实践的注意。

广西侗族人群稀有血型Mur抗原的调查研究

目的:了解广西侗族人群Mur稀有血型抗原的频率,更好的指导本地区的临床输血。方法:对检测人群严格入选标准,采用试管法进行Mur+筛选。结果:844名广西侗族人群筛选出Mur+130人,频率为15.4%,其阳性率明显高于我国上海及广东番禺地区,低于云南怒族人群。结论:Mur稀有血型抗原的阳性率在不同地区及各民族之间存在着较大的差异。

体外培养软骨细胞凋亡与caspase-3表达的实验研究

目的 探讨软骨细胞体外培养过程中凋亡发生以及 caspase- 3的表达。 方法 采用 Annexin 和TU NEL 法检测第 1～ 4代软骨细胞在体外正常培养体系中第 3天和第 7天的凋亡率 ;RT- PCR和 Western blot分析caspase- 3表达水平 ;EL ISA检测 caspase- 3蛋白酶活性。 结果 第 1～ 4代软骨细胞在体外培养过程中均存在不同程度的凋亡现象 ,各代次软骨细胞第 7天的凋亡率 15 .7%± 0 .3% ,明显高于第 3天的 8.9%± 0 .6 % ,有统计学意义 (P<0 .0 1)。caspase- 3m RNA和蛋白质在整个培养过程中都有表达 ,随着时间延长表达上调 ,第 7天的表达水平高于第 3天。体外培养 7天后 caspase- 3被激活 ,可检测到分子量为 2 0 ku的裂解片段。caspase- 3蛋白酶活性随着培养时间延长也逐渐增高 ,与细胞凋亡程度基本一致。 结论 软骨细胞在体外培养过程中存在凋亡 ,caspase- 3参与了凋亡事件并发挥着重要作用。

周期蛋白A在白血病细胞中表达意义的临床与实验研究(英文)

不断增殖是肿瘤的基本特征。一些基本的细胞周期调控分子参与了肿瘤的形成。细胞周期蛋白A(cyclinA)是在G1/S期表达的细胞周期蛋白 (cyclin) ,其异常高表达参与了肿瘤的形成。为了探讨cyclinA异常高表达与白血病细胞恶性增殖的关系 ,采用流式细胞仪胞浆内间接免疫荧光 /DNA双染色法半定量分析了急性白血病患者、门诊接受骨髓穿刺的患者、健康献血者这三种不同来源的外周血或骨髓标本细胞 ,以及白血病细胞系 (HL 6 0 )cyclinA表达水平。为了进一步研究cyclinA在白血病细胞增殖中的作用 ,用在体内、体外均有抗肿瘤作用的六亚甲基二乙酰胺 (HMBA)在体外抑制白血病细胞系HL 6 0增殖 ,并诱导其分化。增殖抑制效应采用四唑盐还原试验和细胞周期分析来检测。细胞表面分化抗原CD33、CD11b改变来检测分化。结果发现 ,两组来自白血病标本的细胞S期cyclinA (即急性白血病患者外周血或骨髓幼稚细胞和白血病细胞系 )表达阳性率要远远高于另两组 (门诊骨髓穿刺的患者骨髓细胞和健康献血员外周血细胞 ) ;在HMBA抗肿瘤细胞系HL 6 0增殖实验中发现随药物剂量的加大 ,增殖抑制和分化程度呈剂量依赖性 ;同时 ,胞内cyclinA蛋白表达水平被明显下调了 ,也呈剂量依赖性。结论 :白血病细胞S期cyclinA异常高表达 。

血小板输血反应及其对策

血小板输血反应是指由于免疫性或非免疫性原因,使输入患者体内的血小板发生异常破坏,而引起发热、输血相关急性肺损伤、血小板输注后紫癜（post-transfusion purpura,PTP）、血小板输注后无效（platelet transfusion refractoriness,PTR）等输血不良反应[1]。本文对血小板输血反应及其对策作一简述。

K562细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究

目的探讨人的树突状细胞(dendriticcell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。方法自健康人浓缩白细胞制品(白膜)分离有粘附特性的单核细胞(PBMC),经GMCSF、IL4培养5d后,获得未成熟的DC(imatureDC,imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA。抽提转染前后以及转染24h后的DC内RNA进行RTPCR检测,Westernblot分析p210蛋白表达,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等。PBMC以每组5×106/ml,分别在不同组分的培养液中培养DC,通过细胞计数、流式细胞仪测定CD1a表达、细胞纯度来估计制备效果。结果RTPCR检测表明DC经K562总RNA转染后,细胞内出现BcrAbl的cDNA条带,24h后消失。Westernblot试验表明转染24h后,开始表达p210特征性蛋白;并且明显促进T细胞对K562的杀伤活性。1%自体血浆体积分数RPMI1640培养的DC的CD1a表达量最高,并且细胞获得数量也仅屈居第二,为总体评价较高的一组。结论应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗具有可行性,预示改良的DC疫苗抗肿瘤的广泛应用前景。

抗-D抗体的定量测定与效价测定的比较性研究

目的Rh系统血型同种抗体是造成严重新生儿溶血疾病的最主要因素。在发达国家和地区,RhD同种抗体监测通常使用抗体定量方法,而在我国通常采用效价测定方法。本研究针对效价测定法与抗体定量法的相关性进行比较,研究效价测定法是否可以真实反映抗体效力。方法本研究中,对17份效价大于64的抗-D血浆样本的效价与抗体定量法进行比较研究,效价法采用ORTHOVISION自动血型检测仪进行自动凝胶柱法检测,抗体定量采用自动连续流抗体定量仪(WHS-D0120)进行检测。结果通过研究,本研究团队发现,抗体效价法与抗体定量法并不是总一致,其相关性为r=0.92(P<0.001),通过对n≥3的效价组(256组、512组、2048组)的比较研究发现,256组与512组间差异有统计学意义(P<0.001),256组与2048组间及512组与2048组间差异无统计学意义(P>0.05),通过单核细胞单层实验,发现效价为256的四份抗体血浆吞噬率组存在较大差异。结论对RhD阴性的患者及孕妇血浆的抗-D评估及监测,抗体定量法较效价法更为精确。

抗-D交联的SiO_2纳米磁珠在稀有血型筛选中的应用研究

目的为开发新型的大规模稀有血型筛选方法,达到无需二抗、减少稀有抗体用量的目的,本研究尝试对二氧化硅包裹超顺磁性纳米颗粒(SPION@SiO2)表面进行修饰并连接抗-D试剂,探讨将IgG型单抗与纳米材料连接的可能性及其在血型筛选上的应用效果。方法制备油酸铁前驱体,通过热解,合成超顺磁性氧化铁球形纳米颗粒(SPION)。采用反微乳液法,在环己烷-非离子表面活性剂-氨水-TEOS体系中,获得SPION@SiO2。利用带有巯基的硅烷偶联剂,制备SPION@SiO2-SH纳米颗粒。产物通过电镜、磁化强度测定进行表征和分析。

脐血造血干/祖细胞体外培养的实验研究

目的 深入了解脐血的造血功能。方法 采用体外半固体甲基纤维素培养法，检测了脐血中造血干细胞和造血祖细胞的含量。结果 经过１４ ｄ 的体外培养，粒单祖细胞集落为（８６±２６）个，多向造血祖细胞集落为（１３１±７１）个。经过８周的体外培养，起始细胞为（８６±２６）个集落。

人类ABH抗原种属特异性研究

人类 ABH 红细胞血型抗原种属特异性从30年代起就有学者用人血清多克隆抗体和动物免疫多克隆抗体进行研究。他们发现某些动物的红细胞也有 ABH 抗原。这些动物的ABH 抗原能与多克隆抗体中部分抗体结合。根据对多克隆抗体 ABH

红细胞低温显微动态图象处理技术的建立和应用研究

本文报道了一种新型的低温生物学实验系统——红细胞低温显微动态图象处理系统,该系统将先进的计算机控温、图象处理技术和低温显微镜及摄录象机有机地联成一体。将此技术应用于红细胞的低温冰冻保存实验,具有能实时记录血细胞在冰冻过程中的实验参数(如时间、温度、降温速率等)与细胞图象,能对其图象处理及面积、体积测量,也能使细胞呈现伪彩色及测定红细胞冰冻损伤程度。该系统是一新的综合性的低温生物学研究仪器,对研究器官保存与移植具有明显意义。

广西侗族人群ABO及Rh血型分布调查分析

目的:了解广西侗族人群ABO及Rh血型分布及基因频率。方法:对检测人群严格入选标准,随机抽取1927例非血缘关系的广西侗族人群进行ABO及Rh血型鉴定和分析。结果:ABO血型分布特征:O>B>A>AB;基因频率p(A)=0.1556、q(B)=0.1920、r(O)=0.6524;Rh(D)阴性率为0.052%,d基因频率0.0228。Rh发现8种表型,以CCDee频率最高(65.28%),未发现CCDEE表型。组合体基因频率以CDe(0.8080)为最高。结论:广西侗族人群ABO、Rh血型分布符合国内南方少数民族的分布特征,但Rh阴性比例明显低于汉族人群。

人类白细胞抗原Ⅱ基因对乙型肝炎病毒易感性和干扰素抗病毒治疗的影响

目的 探讨人类白细胞抗原 (HLA) DRB1和 DQB1等位基因多态性是对乙型肝炎病毒 (HBV)易感性及干扰素 (IFN)抗HBV治疗的影响。方法 应用聚合酶链反应 序列特异性引物 (PCR SSP)技术检测上海地区 6 9例慢性乙型肝炎 (CHB)患者的HLA DRB1和 DQB1等位基因以及 2 0 0名健康准骨髓捐献者的HLA DRB1等位基因。其中 32例接受α 1b干扰素治疗 2 4周。结果 CHB患者HLA DRB1 0 6和 DRB1 0 8等位基因的频度高于健康人 (2 .17%对 0 % ,RR =3.96 3,95 %CI :3.4 2 5～ 4 .5 85 ,P =0 .0 17;11.5 9%对 5 .5 0 % ,RR=2 .2 5 3,95 %CI:1.14 7～ 4 .4 2 8,P =0 .0 2 1) ;而DRB1 0 7等位基因的频度则低于健康人 (2 .90 %对 7.75 % ,RR=0 .35 5 ,95 %CI:0 .12 3～ 1.0 2 5 ,P =0 .0 4 7)。IFN治疗的患者中 ,10例应答者DRB1 14等位基因频度高于 2 2例非应答者 (2 0 .0 %对 2 .3% ,RR =10 .75 0 ,95 %CI :1.116～ 10 3.5 5 8,P =0 .0 30 ) ;而DQB1 0 7分布则相反(10 .0 %对 38.6 % ,RR =0 .176 ,95 %CI :0 .0 36～ 0 .85 6 ,P =0 .0 2 2 )。结论 HLA等位基因多态性可能与上海地区人群HBV的易感性和IFN抗HBV治疗有关。与其他HLA DRB1等位基因比较 ,HLA DRB1 0 6和 DRB1 0 8可能与HBV易感性有关 ,而HLA DRB1 0 7则相反 ,?

PMA活化THP-1的巨噬细胞分化标记特征分析

目的了解佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）分化的THP-1（人单核细胞白血病肿瘤细胞）上巨噬细胞标记特征,评估其作为人源巨噬细胞的替代品的可行性。方法用PMA诱导分化THP-1细胞72 h（活化组）,并同步分离随机健康O型献血者的新鲜外周血单个核细胞（PBMC）,其中一部分PBMC用人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）培养7 d（7 d PBMC）,而未处理的THP-1作为未活化组,分别用流式细胞仪分析这4组细胞的CD14、CD16、HLA-Ⅰ、HLA-DR等细胞表型,并分析Fc受体CD32、CD32b的组成;并用已知含人源HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗体、抗-E、健康献血者血浆各1份以及6种未确定抗体特异性但免疫血液学试验检出疑有不规则抗体的血浆与活化THP-1和新鲜PBMC细胞共培养,观察CD14、CD16、HLA-I、HLA-DR等变化;制备O型IgG致敏红细胞和非致敏红细胞,分别用活化THP-1和PBMC细胞与致敏、非致敏红细胞共培养,进行单核细胞单层试验（MMA）。结果观察到THP-1细胞未活化组为CD14~＋CD16^-,活化组为CD14~＋CD16^（＋d）,缺乏PBMC中CD14^-CD16~＋以及非经典CD14^（＋h） CD16~＋,后者在7 d PBMC中明显增加;未活化THP-1表达HLA-Ⅰ类、CD32分子,但HLA-Ⅱ类和CD32b较弱,在PMA刺激后这些抗原或标记分子均升高。发现活化THP-1细胞CD14、CD16分子可被人源性血浆吸附而致下降,而6例未确定抗体特异性的血浆有4例明显降低HLA-Ⅰ类表达。活化THP-1和PBMC均可成功作为单核细胞单层试验的反应细胞,诱导红细胞调理性吞噬。结论 THP-1可替代人单核巨噬细胞作为人源PBMC来源单核巨噬细胞的替代,细胞群落比较少;但是需要注意其与PBMC来源单核巨噬细胞的不同,并具有HLA抗原特异性,因此其应用范围可能比较局限。

广西侗族人群稀有血型筛选

目的了解广西侗族人群稀有血型的的种类与频率。方法采用96孔微量板法筛选成人i、Ge-、Lub、GPA和抗-Wrb血型;试管法筛选Mur+、孟买/类孟买血型;间接抗球蛋白试验筛选Rh稀有血型;120孔微量板法(Olympus微孔板)直接离心试验和间接抗球蛋白试验筛选单克隆抗体检测的稀有血型抗原;96孔微板2 mol/L尿素攻膜试验筛选Jk(a-b-)表型。结果在1 927名侗族人群中分别筛选出Lub-7例、Jk(a-b-)1例;在844例侗族人中筛选出Mur+130例。结论广西侗族人群Mur+频率为15.4%、Jk(a-b-)表型频率为0.052%,和Lub-频率为0.36%,均高于白种人及广东番禺地区;其中Mur+和Jk(a-b-)稀有表型频率高于我国上海地区,Mur+明显低于我国云南怒族人群;Jk(a-b-)高于日本及中国台湾,低于太平洋群岛波利尼亚人。

M-CSF、GM-CSF诱导人源外周血单个核细胞来源巨噬细胞的不同极化和吞噬

目的观察人源外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)在体外培养诱导单核巨噬细胞时是否因刺激剂M-CSF、GM-CSF的不同而造成极化状态差异,并衡量极化状态差异是否伴有吞噬能力的改变,并寻找可能相关的免疫表型标记。方法取健康献血员新鲜外周白膜血,分离获得PBMC后,每一份PBMC都分为MCSF、GMCSF组,分别对应M-CSF或GM-CSF作为诱导剂。培养d7时用诱导得到的单核巨噬细胞分别和致敏红细胞、未致敏红细胞、血小板(Plt)以及葡聚糖-40(dextran-40)共孵育,模拟MMA(单核细胞单层实验),利用流式细胞仪观察吞噬结果。同时用流式分析2组细胞的CD11C、CD14、CD15、CD16、DR、CD32、CD32b、CD49f、CD54、CD64、CD68、CD86、CD163等免疫表型。所有得到的结果进行配对t检验分析差异。结果 MCSF、GMCSF组CD14+CD16+细胞占比分别为(62.6±33.7)%vs(22.8±15.6)%,CD163+CD14+细胞(29.7±18.7 vs 0.64±0.42), CD14 MFI 3 829±2 091vs464±101,(P均<0.05)。同时MCSF组伴随CD64+(45.7±25)%vs(24.5±19)%、CD32b+(59.5±22.4)%vs(27.5±11.8)%细胞占比增高,CD32+、HLA-DR+细胞数虽然无明显变化,但其MFI分别较GMCSF组增高和降低(MFI CD32 1 093±380vs530±179;MFI DR 1 034±290vs1 661±367)。同时发现MCSF组具有较强的吞噬力,对被吞物的吞噬力多数为Plt> Dextran-40>致敏RBC>非致敏RBC。结论证实了人源PBMC诱导的单核巨噬细胞在体外培养时同一起源样品也可因M-CSF、GM-CSF而促成不同极化方向, M-CSF促进M2型极化, GM-CSF促进M1型极化,并由此影响对致敏红细胞、血小板(Plt)以及葡聚糖-40的吞噬能力,因此在临床使用M-CSF、GM-CSF时需注意单核巨噬细胞的极化方向,采取更有利于患者治疗和临床实验的制品。

提高输血疗效必须首先完善输血前血液的相容性试验

血型鉴定与相容性试验直接关系到输血疗效。为避免严重的输血反应，有较多新的免疫血液学技术与方法正逐步应用于输血实验室，如凝胶试验、单核细胞单层分析试验以及血型基因分析等。在这些技术中，有些可提高检测的灵敏度和自动化水平，有些则可更为准确地预示输血后红细胞在体内存活状态。运用这些技术，可使输血的相容性明显提高。虽然在解决疑难血型问题时，并没有通用的方法，但医务工作者可通过选择不同免疫血液学技术进行组合，也可及时为患者提供合适的血液。

肿瘤新抗原肽诱导献血者PBMC特异反应性T细胞

目的观察异基因献血者来源PBMC(peripheral blood mononuclear cells)是否可被来自于肿瘤患者测序来源的新抗原肽诱导为特异反应性T细胞。方法取健康献血者新鲜外周血白膜层,分离获得PBMC后,粘附获得单核细胞,同时冻存PBL(peripheral blood lymphocytes)。单核细胞以每三天加入细胞因子GM-CSF和IL-4进行细胞诱导培养,7天后收获成熟DC(dendritic cells),24孔铺板后分别装载16条肿瘤新抗原肽,其中13条为本项目组前期研究所得,5 h后加入4~10倍细胞数量已复苏的PBL共培养,每三天加入IL-2,对照为不加抗原肽(DC/PBL),加入PHA(Phytohemagglutinin,植物血凝素)PBL孔作为阳性对照;第14天、第21天分别再行新抗原肽脉冲刺激,第22天留取上清液用ELISA方法测量IFN-γ浓度,剩余细胞用流式细胞仪分析CD3^(+)IFN-γ^(+)/CD8^(+)IFN-γ^(+)T细胞占比。结果发现10/13中的每条多肽至少可诱导3份PBL分化为分泌IFN-γ反应性CD3^(+)或CD8^(+)T细胞,同步ELISA测得上清液中IFN-γ浓度也升高,以上结果具有一定的相关性(CD3^(+)或CD8^(+)T细胞r值分别为0.66、0.58,P<0.05)。结论我们成功地建立了用来自肿瘤患者的肿瘤新抗原肽诱导健康献血者的PBMC分化为肿瘤新抗原肽特异性的T细胞。