利用同源重组对酵母人工染色体左右臂进行多基因修饰

构建携带哺乳动物细胞筛选基因和酵母人工染色体(YAC)同源序列的载体,利用酵母中能够发生高频率同源重组的特点对YAC分别进行左、右臂修饰,依次将NEO、EGFP及PURO基因定点整合到YAC左右臂上。用营养缺陷筛选的方法排除酵母发生突变或随机整合等情况后,用PCR及Southern杂交方法证实各筛选基因定点整合于YAC两臂上,从而获得携带3个哺乳动物细胞筛选基因的YAC克隆。并且由此建立了通过同源重组将哺乳动物标记基因定点引入YAC左右臂的多基因修饰平台。

利用酵母人工染色体(YAC)减数分裂同源重组构建人免疫球蛋白κ链基因组大片段

具有同源重叠区的酵母人工染色体(YAC)可以利用酵母细胞减数分裂进行同源重组,从而构建更大的人工染色体基因组,这对生命科学基础研究和生物技术应用研究有着非常重要的意义。本实验以两个含人免疫球蛋白κ链基因簇片段的YAC克隆为材料,通过酵母改型、异型接合、二倍体发孢、单孢子筛选和分子生物学鉴定等技术和方法,利用酵母菌减数分裂同源重组机制,构建了一条包含人的免疫球蛋白κ轻链32个Vκ基因、5个Jκ基因、Cκ基因、Eκ基因和κde基因的YAC重组体,长度约400kb。同时,本实验利用溶壁酶消化法获取单孢子重组体,代替了传统的显微分孢操作。使得利用酵母人工染色体减数分裂同源重组的技术更加简便可行。