重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性研究

目的探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的重组表达多表位肽刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定重组多表位肽的免疫原性。结果以刺激系数(SI)>3为界,多表位肽(10μmol)能刺激全部10例HLA-A*0201阳性(A2+)结核菌素阳性(PPD+)健康个体的PBMC发生增殖,SI为46.2±5.6;增殖反应明显高于单肽(平均SI为10.2±2.3)以及PPD(平均SI为15.6±3.6)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在多表位肽诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽(10μmol)的T2细胞作为靶细胞,多表位肽诱导的CTL作为效应细胞,多表位肽能诱导全部的10例A2+PPD+健康个体中CTL杀伤活性,平均活性分别为(86.2±9.6%),显著高于单肽[平均为(25.4±3.6)%]和PPD[平均为(22.6±2.8)%](P<0.01)。结论重组优化多表位肽在细胞水平具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性。

联合检测在肝纤维化诊断中的作用

目的:为探讨血清中Ⅳ型胶原(COLIV)、Ⅲ型胶原N端肽(PⅢNP),以及白细胞介素-6在肝纤维化诊断中的作用。方法:用ELISA法检测COLIV,采用放免法检测PⅢNP,LI-6用酶免法测定。用于对肝纤维化进程中的代表性疾病,如慢性迁延性肝炎(chronispersistenthepatitisCPH),慢性活动性肝炎(chronisactivehepatitisCAH),肝硬化(livercirrhosisLC)和健康对照进行对比,并对65份病例采用肝活检及肝组织切片纤维染色分级。肝纤维化诊断分五期(S0-S4),统计三者的血清值。结果:各病理组织学纤维化分期与血清指标呈显著正相关(r=0.980,P<0.01;r=0.974,P<0.01;r=0.983,P<0.01)。随着肝脏纤维化程度增加三项检测指标均呈显著性相关。尤其对于CAH、LC阶段,P<0.005,结论:联合检测COLIV、PⅢNP和LI-6在肝脏纤维化分型及预后判断上有很大价值。

蛋白质组学及其在肿瘤标记物筛选鉴定中的应用

蛋白质组学是针对蛋白质组研究的一门新兴学科,包括结构蛋白质组学和功能蛋白质组学,主要是在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律。近年来多种新技术的应用极大地推动了蛋白质组学的发展,同时也成功地应用于肺癌、乳腺癌、结肠癌、膀眈癌、前列腺癌和肾癌等常见肿瘤标记物的筛选鉴定。蛋白质组学研究的迅速发展在生命科学领域已取得了许多成果,显示出强大的应用前景,对肿瘤的诊断、治疗、监控及肿瘤相关机制的探讨具有重要意义。

低剂量颗粒溶素对单核细胞和T细胞具有趋化作用

目的探讨低剂量颗粒溶素(GNLY)对免疫细胞的趋化作用。方法抽取健康人全血,分离出外周血单个核细胞(PBMC),经免疫磁珠法纯化出单核细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD45RA+T细胞、CD4+/CD45RO+T细胞、CD8+/CD45RA+T细胞和CD8+/CD45RO+T细胞,再用96孔微孔趋化板进行趋化反应。结果颗粒溶素可趋化一些T细胞系、单核细胞系,趋化指数≥2(P<0.05),而对B细胞系的趋化指数为<2。用百日咳毒素预处理过的T细胞系、单核细胞系不再对颗粒溶素有反应,提示颗粒溶素介导的趋化作用涉及G蛋白偶连受体。结论颗粒溶素不仅是一种细胞毒性分子,而且具有化学趋化作用。颗粒溶素在10～100μmol发挥细胞毒活性而在相对较低的浓度下发挥趋化作用且此效应涉及G蛋白偶连受体。

隐球菌性脑膜炎患者外周血中TLR4的表达以及血清中TNF-α，IL-10的水平研究

目的探讨Toll样受体4（TLR4）在隐球菌性脑膜炎患者外周血中的表达，以及研究血清中TNF—α，IL-10的变化情况。方法收集25例隐球菌性脑膜炎患者和25例健康体检者全血，采用荧光定量PCR（FQ—PCR）检测TLR2，TLR4的mRNA表达。ELISA法检测血清中TNF—α，IL-10的表达。结果隐球菌性脑膜炎患：者TLR4 mRNA的表达显著低于对照组（0．35±0．18）（P〈0．05），TLR2均无显著变化（0．87±0．23）（P〉0．05）。血清中的IL-10显著升高（4．25±1．30）pg／ml（P〈0．05），TNF—α的变化不显著（1．49±0．87）pg／ml（P〉0．05）。结论隐球菌性脑膜炎患者TLR4 mRNA表达显著下降，可能在隐球菌性脑膜炎的发病过程中起一定的作用。

结核分枝杆菌Rv0309抗原的重组表达、纯化和鉴定

目的重组表达结核分枝杆菌Rv0309蛋白,以进一步探讨其免疫效应。方法将结核分枝杆菌抗原Rv0309的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成Rv0309重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,进一步经GST亲合层析柱纯化,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白。结果获得了pGEX4T-Rv0309重组子,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组Rv0309蛋白,其条带大小约23000,与预期结果相符。结论成功地进行了结核分枝杆菌抗原Rv0309的基因克隆与重组表达,为进一步研制新型结核病疫苗打下了基础。

OGDC-E2和BCOADA-E2的二联体检测在原发性胆汁性肝硬化中的意义

目的通过重组表达抗原OGDC-E2和BCOADC-E2的二联体融合蛋白(B0),并用于检测自身抗体及临床意义。方法重组表达的融合蛋白(B0),通过Ni-NTA亲和柱纯化,经过免疫印迹法(IBT)和酶链免疫吸附(ELISA)法检测56份PBC患者血清,以48份自身免疫病患者、50份其他肝病患者、70例正常人血清为对照组。结果56例确诊的PBC患者中,42例阳性,阳性率为75.0%。而健康体检者和疾病对照组血清中的M2抗体均为阴性。结论通过用重组表达的二连体B0检测PBC患者血清中的M2抗体,具有一定的特异性及敏感性,为临床进一步研究PBC,辅助诊断提供一些辅助参考。

重建外周免疫耐受抑制原发性胆汁性肝硬化的实验研究

目的以原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）自身抗原诱导PBC小鼠重建外周免疫耐受，探索PBC免疫治疗的新途径。方法将M2蛋白≮新生小鼠的脾淋巴细胞及交联剂1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二哑胺（ECDI）共培养，形成抗原负载的淋巴细胞，随后通过尾静脉注入小鼠体内诱导免疫系统埘PBC自身抗原的免疫耐受，同时注射聚肌苷酸胞苷酸（polyI：C）诱导PBC病变，对照组注射与牛血清白蛋白（BSA）共培养的脾细胞，16周后观察小鼠的各项实验室指标，分析重建PBC小鼠外周免疫耐受是否能够有效地阻止病变产生或缓解病程。结果抗线粒体抗体（AMA）：免疫耐受组与BSA对照组、模型对照组相比阳性率显著降低，差异有统计学意义（P=0．007，P＝0．003）；BSA对照组和模型对照组间无明显差异（P＝：0．74）；免疫耐受组、BSA对照组、模型对照组的碱性磷酸酶（AKP）水平分别为（80．5±9．8）U／L、（93．8±15．7）U／L、（92．5±17．7）U／L；其中BSA组和模型组差异无统计学意义（P=0．83），而免疫耐受组低于BsA组（P=0．0095）和模型对照组（P=0．029）；免疫耐受组、BSA对照组、模型对照组的胆管阳性浸润率分别为42．67％±12．30％、57．07％±11．35％、51．53％±9．96％；其中免疫耐受组阳性浸润率低于模型对照组，差异有统计学意义（P=0．039），同时显著低于BSA对照组（P＝0．0024），而且．BSA对照组和模型对照组比较差异无统计学意义（P=0．167）。结论本实验通过重建外周免疫耐受，在一定程度上抑制了PBC小鼠的病变程度，为今后进一步研究PBC的免疫治疗提供思路。

应用聚肌胞苷酸建立原发性胆汁性肝硬化动物模型

目的应用聚肌胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid,poly I:C)建立原发性胆汁性肝硬化(PBC)动物模型。方法80只C57BL/6雌性小鼠,分为空白对照组(5只)、poly I:C 5mg/kg组(25只)和10mg/kg组(25只)、阴性对照组(25只)。poly I:C 5和10mg/kg组小鼠腹腔分别注射poly I:C 5和10mg/kg,每3天1次,阴性对照组用等体积无菌PBS液注射。每4周处死一批小鼠,同时检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、抗核抗体(ANA)、抗线粒体抗体(AMA)水平,肝组织行H-E染色后镜下观察胆管组织学变化;Annexin V检测脾细胞凋亡。结果5mg/kg组第4周小叶间胆管开始出现炎性细胞浸润,浸润的胆管数量随注射时间延长而增加,第20周达51%;血清AMA阳性率逐渐增高,16周达4只(共5只),最高滴度达1:10000。10mg/kg组ANA、AMA均在第8周时明显升高,但随后呈下降趋势,其他指标与5mg/kg组差异无统计学意义(P>0.05)。5mg/kg组血清ALP显著高于阴性对照组(P<0.05)。poly I:C两组脾细胞早期凋亡率均明显高于阴性对照组(P<0.05),但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。阴性对照组仅出现ANA阳性,其他指标均无明显变化。结论poly I:C(5mg/kg)注射16周后可初步建立PBC动物模型。细胞凋亡后释放的自身抗原活化自身反应性淋巴细胞在PBC的发病中可能起重要作用。该模型的建立为今后PBC发病机制和治疗的研究奠定了基础。

氧化型低密度脂蛋白对单核细胞Toll样受体4表达的影响

血清中高浓度的低密度脂蛋白是冠心病的主要危险因子，而氧化型低密度脂蛋白（OX—LDL）比其天然形式的致动脉粥样硬化作用更强。Toll样受体4（TLR4）与动脉粥样硬化的发生发展密切相关，在粥样斑块组织特别是在脂质丰富、巨噬细胞浸润的部位显著表达和活化。TLR4启动的胞内信号转导最终能激活核因子kappa B（NF—κB），诱导单核／巨噬细胞产生免疫炎性细胞因子、共刺激分子以及黏附分子等。

原发性胆汁性肝硬化模型中淋巴细胞增殖及活化诱导凋亡机制研究

目的通过检测原发性胆汁性肝硬化（PBC）动物模型肝脏和脾脏淋巴细胞增殖及活化诱导凋亡（AICD），了解PBC模型小鼠的免疫耐受情况。方法聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸（polyI：C）5mg／kg剂量注射C57BL／6小鼠建立PBC模型，分离肝、脾淋巴细胞并纯化CD4^＋T淋巴细胞，然后以M2蛋白及刀豆蛋白A（ConA）结合抗-CD3刺激细胞增殖及AICD，定量PCR和免疫印迹技术检测凋亡相关基因及信号蛋白。结果①M2蛋白刺激后，空白对照组和PBS组的细胞增殖能力（分别为0．1988±0．0111和0．2068±0．0115）差异无统计学意义（P〉0．05），但是PBC组小鼠细胞增殖能力（0．358±0．022）与以上两组相比显著增强，且PBC组小鼠肝内淋巴细胞增殖能力强于脾淋巴细胞（P〈0．01）。②空白对照组和PBS组之间AICD情况差异无统计学意义（74．70％±4．58％比74．20％±4．44％，P〉0．05），但均显著高于PBC组（44．85％±6．47％，P〈0．01），同时PBC组小鼠肝内CD4^＋T细胞的凋亡率显著低于脾脏（P〈0．01）。③PBC组小鼠肝脾淋巴细胞FasL、TRAIL基因的表达较PBS组均明显降低（P〈0．01），而Fas表达无明显改变。④PBC组小鼠CD4^＋T细胞长构型Fas相关死亡区域样白细胞介素-1G转化酶抑制蛋白（FLIPL）表达明显升高，且肝内T细胞表达较脾脏显著增加（P〈0．01）。结论FLIPL表达增高可能是AICD受到抑制的重要原因，同时FasL和TRAIL mRNA表达降低可能也起到一定的作用。

IL-27诱导原发性胆汁性肝硬化患者CD4^＋T细胞增殖分化作用机制研究

目的 探讨IL-27对原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis,PBC）患者外周血CD4＋T细胞的增殖分化作用及其相关免疫学机制.方法 收集PBC患者、慢性乙肝患者（choronic hepatitis B,CHB）、健康体检者（health controls,HCs）外周血,磁珠分离CD4＋T细胞.IL-27体外作用后,CCK-8测定细胞增殖情况,ELISA法检测细胞因子,定量PCR分析T-bet和GATA3基因表达情况,免疫印迹测定p-STAT-1和p-STAT-3的表达.结果 IL-27作用后,PBC组、CHB组和HCs组CD4＋T细胞增殖能力均显著增强,PBC组CD4＋T细胞增殖能力强于CHB和HCs组,差异有统计学意义（P＜0.001）,同时PBC组细胞培养液中IL-2和IFN-γ在IL-27作用后较CHB和正常对照组均显著增高（P＜0.001）,IL-10表达无明显变化.未经IL-27诱导情况下,PBC组T-bet表达高于CHB组（P=0.007）,IL-27诱导后PBC组CD4＋T淋巴细胞T-bet基因表达显著增加,同时对GATA3具有抑制作用,作用前后差异有统计学意义（P＜0.001）,CHB组作用前后无显著变化（P=0.3）.免疫印迹测定p-STAT-1、p-STAT-3发现,正常情况下各研究组均不表达p-STAT-1、p-STAT-3,IL-27作用后,表达明显升高,其中PBC组升高尤为明显.结论 IL-27可以诱导PBC患者CD4＋T细胞增殖,并通过活化p-STAT-1、p-STAT-3信号通路,诱导CD4＋T细胞向Th1分化,同时分泌相关细胞因子,可能在PBC早期免疫炎症反应过程中具有重要作用.