非血管化的脂肪移植后脂肪细胞的命运：脂肪细胞早期死亡和替换的证据

背景与目的脂肪移植的临床效果是一种可变因素，而且其依赖于所采用的技术，同时，移植组织怎样建立血管化是未知的。近来，我们通过对蛋白进行免疫组化染色，而非HE染色，对存活和死亡的脂肪细胞进行观察。方法利用如下方法对人类脂肪组织中各细胞成分（脂肪细胞，脂肪干细胞／间质细胞／祖细胞，血管内皮细胞，造血细胞）的生存能力进行评价：①储存脂肪抽吸物；②培养细胞；③培养功能性脂肪组织。此外，将小鼠腹股沟脂肪垫（150～200mg）移植于头皮下，并在第0、1、2-,3、5、7、14天对移植物进行染色。结果体外研究显示，尽管脂肪来源间质干细胞可以保持3d的活性，但在缺血环境条件下脂肪细胞最易受影响而死亡。体内研究证实，大多数移植脂肪细胞在第1天开始死亡，仅有少部分距离组织边缘300μm的脂肪细胞存活。增殖细胞的数量在第3天开始增多，从第7天开始活性脂肪细胞区域增大，提示坏死组织的修复重建过程开始。结论我们展示了非血管化的脂肪移植后脂肪组织最大程度有活力模型的令人信服的证据。我们观察到移植组织由外围至内部分为3个区域：存活区域（脂肪细胞存活），再生区域（脂肪细胞死亡，脂肪来源间质干细胞存活，坏死脂肪细胞由新生的脂肪细胞替换），坏死区域（脂肪细胞核脂肪来源间质干细胞均死亡）。

抽吸与切取方法获取的脂肪组织的结构特征和细胞组成的对比研究

背景脂肪组织是一种容易获取的组织，可当做软组织填充物，也是成人多功能细胞的来源，这种多功能细胞被称为脂肪源性干细胞／基质细胞／祖细胞。然而，由于脂肪细胞和脂肪组织的结构很脆弱，脂肪细胞的许多解剖特征仍不清楚。方法纳入抽吸方法获取的皮下脂肪组织标本15例，完整皮下脂肪组织标本9例，采用以下方法进行评估：①采用组织全层包埋结合三重荧光染色技术，对活脂肪组织进行三维成像；②甘油一3．磷酸脱氢酶试验；③多色流式细胞术（CD34、CD31和CD45）；④培养血管基质部分细胞的贴壁细胞，以产生脂肪源性基质细胞。结果组织全层包埋方法显示脂肪组织旁存在毛细血管网，抽吸获取的脂肪组织中的毛细血管网被部分破坏。抽吸脂肪组织也缺少大的脉管结构，其小脂肪粒（破碎脂肪组织，P=0．00016）和死亡细胞（P=0．0038）的数量均高于切取脂肪组织。抽吸与切取的脂肪组织中，脂肪细胞数量占全部细胞数的比例均小于20％，且脉管系统相关细胞（包括内皮细胞和脂肪源性基质细胞）占到细胞总量的一半以上。甘油一3．磷酸脱氢酶试验显示，抽吸和切取脂肪组织中破裂的脂肪组织所占百分比分别为大于30％和5％（P=0．032）。多色流失细胞术分析结果显示，抽吸脂肪组织中受污染的血源性细胞（CD45＋）数量在总细胞中所占百分比更大（P=0．0038），抽吸脂肪组织内的脂肪源性基质细胞产量大约是切取脂肪组织的一半（P=0．011）。结论作者研究表明两种组织有不同的结构特征和细胞成分，且抽吸脂肪组织内组织损伤更严重，祖细胞产量也不足。

局部缺血时的脂肪组织重构：脂肪细胞的死亡与干／祖细胞的激活

背景许多整形外科手术后（如脂肪移植），脂肪组织开始缺血，导致组织缺氧和营养缺失。然而，很少有研究检测脂肪组织中的缺血和／或缺氧变化的报道。方法切断小鼠体内为腹股沟脂肪垫供血的血管，建立外科手术诱导的缺血模型。利用氧气监视器测量脂肪组织的氧分压，利用全标本染色、免疫组化、流式细胞术和蛋白质印迹法分析缺血改变。作者还检测了体外低氧环境下的细胞寿命。结果3种程度缺血模型（轻度、中度、重度）的氧分压水平分别为正常脂肪组织（50．5±1．3）mmHg的75％、55％、20％。在第28天观察到脂肪组织萎缩伴随实质纤维变性，这取决于缺血的严重程度。在第1天观察到中度和重度缺血诱导低氧诱导因子1仪和纤维生长因子2表达的提高，中度和重度缺血还可导致脂肪组织中的退行性改变（如细胞凋亡、坏死、巨噬细胞侵噬）。死亡细胞包括脂肪细胞，血管内皮细胞，血源性细胞，但不包括脂肪源性干／祖细胞。退行性改变后可观察到再生性改变，包括血管形成、脂肪形成和细胞的增殖（包括脂肪源性干／祖细胞、血管内皮细胞和血细胞）。笔者还发现，严重缺氧时在体外用实验方法分化的脂肪细胞发生凋亡和／或坏死，而脂肪源性干／祖细胞仍然存活。结论脂肪组织严重缺血／缺氧导致退行性改变，继而发生相应的组织重构。在缺血环境下，脂肪细胞很容易死亡，而脂肪源性干／祖细胞却非常活跃，并有助于组织修复。

抽吸获取的脂肪组织中活脂肪细胞、未成活脂肪细胞和其他细胞成分数量的测定

背景分析脂肪组织中脂肪细胞和其他细胞成分生存能力和数量的方法仍需进一步评估。方法作者采用抽吸法获得1g脂肪组织，利用离心分离法将脂肪组织分层（顶层、中层和底层），利用烟酸己可碱33342和碘化丙啶为细胞染色，采用二甲氧唑黄比色法（2，3-bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）-5-[（phenyl-amino）carbonyl]-2H-tet-razoliumhydroxide，XTT）和甘油一3．磷酸脱氢酶试验（n=10）评估细胞生存能力和数量。分析配制细胞（脂肪细胞，脂肪基质细胞，和白细胞）数量与XTY和甘油-3-磷酸脱氢酶试验分析结果之间的关联（凡=5）。从相同脂肪组织中分离血管基质部分细胞，并利用多色流式细胞术检测其细胞成分（n=5）。结果烟酸己可碱33342和碘化丙啶染色法将活的脂肪细胞从脂肪粒，死亡脂肪细胞和其他细胞中区分开。作者从1g的抽吸脂肪组织中获得6．9×10^5个未破碎脂肪细胞；原脂肪细胞中有30％发生破碎。XTT和甘油-3-磷酸脱氢酶试验均显示了活脂肪细胞的数量与分析结果之间具有显著相关关系，但是只有甘油-3-磷酸脱氢酶试验结果对脂肪细胞有严格特异性。本研究还发现，脂肪基质细胞与脂肪细胞的比率大于之前研究的描述。结论本研究中单独使用一种或联合使用2种生存能力分析法，均能确定脂肪细胞和其他细胞的数量，但是不采用组织分离而直接评估原始细胞仍有困难。

人类脂肪来源干细胞经长期深低温保藏后保留的增殖能力和多能性

背景人类脂肪来源干（问质）细胞作为间叶细胞谱系（包括脂肪、骨骼肌和心肌、骨、软骨、血管）组织缺损的再生疗法的工具，是很有应用前景的。同其他领域所发生的一样（包括造血干细胞和脐带血细胞在基于细胞的治疗方法中的应用），在未来可能的临床应用中，脂肪来源干细胞深低温保藏也许是一项必不可少的基本技术。方法作者从18例患者抽吸获得的脂肪中分离出脂肪来源干细胞，并在干细胞深低温保藏6个月前后分别检测它们的增殖能力和多功能性，深低温保藏过程遵循他们已确定的方案。通过检测培养细胞的倍增时间对细胞增殖能力进行量化分析，通过分析脂肪来源干细胞向成软骨、成骨和成脂谱系细胞的分化确定细胞的多功能性。另外，通过流式细胞术确定细胞表面标记物的表达谱，并对新鲜的和经深低温保藏的脂肪来源干细胞表面标记物的表达谱进行对比。结果经深低温保藏的脂肪来源干细胞完全保存分化成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞的能力及增殖能力。流式细胞术分析结果显示深低温保藏前后细胞表面标记物表达谱保持不变。结论在现有的方案下，脂肪来源干细胞至少可深低温保藏6个月，且不损失任何增殖能力和分化潜能。这些结果保证了自体库存的脂肪来源干细胞在未来临床应用的可用性。