人E钙粘素融合蛋白基质对人骨髓间充质干细胞向肝细胞定向诱导分化的影响研究

人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)源的肝细胞对于肝脏疾病的治疗和药物的开发具有巨大的应用潜力。利用基因工程技术构建了融合蛋白质粒,并通过真核细胞表达体系表达出了人E-钙粘素胞外域与免疫球蛋白Fc段的融合蛋白(hE-cadherin-Fc),并将其用于疏水材料的表面修饰仿生构建细胞-细胞间相互作用的细胞外微环境,检测其对hBMSCs向肝样细胞定向诱导分化的影响。诱导分化培养4周后,与组织培养板(TC-PS)、明胶(Gelatin)基质相比,hE-cadherin-Fc基质显著促进细胞表达ALB、CK18、HNF-4等肝细胞分化基因,并且细胞的糖原合成和吲哚青绿(ICG)摄取功能均显著提高。在hE-cadherin-Fc基质表面分化培养4周时,白蛋白和尿素合成的量为2.7pg/细胞/d和36.7 pg/细胞/d,相对于TC-PS和Gelatin分别提高了42.1%和28.6%、57.5%和25.7%。综上所述,利用hE-cadherin-Fc基质化构建细胞外微环境,有利于促进人骨髓间充质干细胞向功能化肝细胞的定向分化。

高机能肝细胞培养支架--海藻酸/半乳糖化壳聚糖海绵体的开发

重症肝功能衰竭是导致死亡的主要疾病之一。目前,肝移植是其唯一有效的临床治疗手段,但供体不足及伦理等问题,使不能及时得到治疗而死亡的患者正在逐年增多,随着组织工程学的发展,人们都寄希望于生物型人工肝脏。笔者正在研究开发三维立体肝细胞培养支架材料,探索体外肝组织再构筑技术和方法,实现高效生物型人工肝脏。笔者研究根据半乳糖残基与肝实质细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体的特异性结合作用,利用半乳糖残基化学改性天然高分子多糖壳聚糖,改善壳聚糖的肝实质细胞亲和性,并制成三维多孔海藻酸／半乳糖化壳聚糖海绵体肝细胞培养支架。从培养细胞形态学和肝功能等生化学分析角度考察了用该支架培养肝实质细胞的聚集体形成及肝功能等。

P19细胞心肌体外分化诱导条件的优化

目的 分别观察P19细胞心肌分化诱导中的几种影响因素，优化P19细胞心肌分化的诱导条件。方法使用悬滴法或96孔板悬浮培养法制备细胞聚集体（aggregates），二甲基亚砜（DMSO）为诱导剂诱导P19细胞的心肌分化。普通光学显微镜下观察跳动的心肌细胞的产生来确定诱导是否成功，免疫荧光染色确认心肌特异性蛋白Troponin T的表达，RT-PCR方法检测分化诱导后心肌细胞标志基因的表达情况。结果使用96孔板悬浮培养法诱导细胞形成聚集体后转入贴壁培养阶段时细胞聚集体贴壁状态优于传统的悬滴法。DMSO的加入可以提高细胞形成聚集体后贴壁时细胞聚集体的完整性。1×10^7～2×10^8L^-1的接种浓度下心肌细胞分化诱导效率较高。在可观察到跳动的心肌细胞之前即可检测到Troponin T的表达。结论通过对细胞形成聚集体的诱导方法、诱导剂、接种浓度等因素的优化可以提高P19细胞的心肌分化效率，为开发高效心肌分化诱导法提供了条件。