大豆GmWRI1a基因克隆及生物信息学分析

利用Phytozome数据库、NCBI网站等软件对大豆(Glycine max)基因组中WRI1同源基因进行生物信息学分析,发现大豆WRI1转录因子有2个拷贝,分布在第8和15号染色体上。以大豆未成熟种子cDNA为模板,克隆15号染色体WRI1转录因子的cDNA全长序列,命名为GmWRI1a。应用生物学软件发现,GmWRI1a蛋白含有2个AP2/EREBP结构域(60-225)。进化树分析表明,GmWRI1a包含在第一个分支里,与AtWRI1距离较近,推断其与AtWRI1属于同源基因,具有相似的功能。对与GmWRI1a蛋白存在相互作用的蛋白进行预测分析,发现与其相互作用的蛋白多数参与糖降解或质体脂肪酸合成,结果表明,GmWRI1a转录因子可能在控制种子发育中时从糖到油的碳流动中起重要作用。

大豆RING/U-box蛋白Glyma.13G115900的克隆及其对非生物胁迫的应答

课题组前期对干旱胁迫下大豆转录组的数据分析发现大豆Glyma.13G115900基因编码一个RING/U-box蛋白,其表达水平受干旱胁迫影响显著。本研究以垦丰16大豆为试验材料,克隆Glyma.13G115900基因。氨基酸多重序列比对表明其编码的蛋白与其它物种都具有高度保守的RING/U-box结构域。构建原核表达载体pET-29b-Glyma.13G115900转化到大肠杆菌中,Glyma.13G115900蛋白在大肠杆菌中能够表达。荧光定量PCR分析表明Glyma.13G115900基因的表达量受PEG、NaCl和ABA的影响显著,但基本不受冷胁迫的诱导。经PEG和NaCl处理后,该基因表达量与CK相比呈现出显著下降的趋势,PEG处理的表达量变化比NaCl下调的更明显;在ABA诱导下与CK相比该基因的mRNA丰度呈现出先上升后下降的趋势,在4 h表达量出现峰值,推测该基因可能通过依赖于ABA途径参与非生物胁迫应答。以上结果为进一步深入研究该基因的调控途径奠定基础。

大豆MPBQ-MT基因的克隆与生物信息学分析

以大豆品种合丰25和Bayfield为材料,克隆大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQMTase)基因,获得1 029 bp的MPBQ-MT基因c DNA序列。通过序列比对发现10个大豆MPBQ-MT基因c DNA区内的潜在SNP位点。采用生物信息学方法分析MPBQ-MT基因编码的氨基酸序列和蛋白质结构。结果表明:MPBQ-MT基因CDS区共编码342个氨基酸,其中缬氨酸(Val)含量最多,占该基因编码氨基酸总数的8.8%;半胱氨酸(Cys)含量最少,占该基因编码氨基酸总数的1.2%;MPBQ-MT蛋白N端包含由58个氨基酸组成的叶绿体转运肽,为亲水性蛋白质。合丰25与Bayfield的MPBQ-MT蛋白质二级结构有所不同,2个品种的MPBQ-MT蛋白质中α-螺旋分别约占25.44%和27.49%,β-转角分别约占9.36%和9.06%,无规则卷曲分别约占40.35%和38.60%。2个品种的MPBQMT蛋白质中片层结构均约占24.85%。两个品种的MPBQ-MT蛋白质均有1个S-腺苷基甲硫氨酸结合位点。对MPBQ-MT蛋白三级结构进行预测,发现去掉转运肽后,MPBQ-MT蛋白质三级结构主要由11个连续的α-螺旋区域和8个连续的片层结构区域组成。结合MPBQ-MT蛋白三级结构对MPBQ-MT基因的生物学功能进一步分析,提出了较为合理的MPBQ-MT作用模型。由系统发生树可知MPBQ-MT蛋白在大豆与菜豆中的亲缘关系较近。

大豆维生素E遗传图谱构建及QTL分析

在黑龙江省三地点对合丰25和Bayfield杂交后的144个重组自交系群体的维生素E中各个成分进行QTL分析。结果发现在哈尔滨共得到8个与维生素E含量相关的QTL,在呼兰共得到9个与维生素E含量相关的QTL,在绥化共得到11个与维生素E含量相关的QTL。通过分子辅助育种法筛选出11个高维生素E含量的品系。

大豆维生素E含量遗传初探

利用高效液相色谱对黑龙江省主栽品种合丰25和加拿大品种Beyfield进行杂交后的重组自交系进行维生素E含量测定,结合主基因加多基因的混合遗传模型,对大豆种子中维生素E各个成分含量进行遗传分析,初步得到大豆中维生素E各个成分的遗传模型,为大豆分子辅助育种奠定基础。

利用GUS基因的瞬时表达优化大豆根癌农杆菌介导的遗传转化

高转化效率是分子育种的重要前提,根癌农杆菌介导的遗传转化由于其有较高的遗传效率和较低的拷贝数成为目前优选方法。为优化大豆遗传转化体系,以本实验室已有转化体系为基础,利用pCAMBIA3301中35S∶GUS基因瞬时表达体系,从萌发时间、切豆方法、侵染时间、共培养方式以及共培养时间等方面对东农47、垦农18和B12088大豆栽培品种的遗传转化体系进行优化。结果表明:东农47萌发1 d,侵染30 min;垦农18和B12088萌发12 h,侵染30 min,GUS基因瞬时表达率最高。在其它的处理上,3个品种表现结果一致,即蘸取菌液切豆,共培养中子叶伤口朝下摆放,黑暗条件下共培养3～5 d,GUS基因瞬时表达最高。3个品种在最适条件下,GUS染色效率均达到90%以上,垦农18遗传转化效率较高。本研究为大豆农杆菌介导子叶节转化方法提供了一个改进的方案,并且为拓宽可利用于大豆遗传转化的种质资源奠定基础。

大豆四向重组自交系群体蛋白质含量与油分含量QTL定位

蛋白质和油分含量是大豆重要的育种目标,蛋白质和油分含量QTL定位和优异等位变异的发掘对大豆分子设计育种具有重要意义。本研究以（垦丰14×垦丰15）×（黑农48×垦丰19）衍生的后代株系为材料,构建含有204个株系的大豆四向重组自交系群体,利用区间作图法,应用前期构建的SSR遗传图谱,对2013、2014和2015年在哈尔滨和克山2地共8个环境下的蛋白质和油分含量进行QTL定位分析。结果表明,8个环境中检测到29个蛋白质含量QTL和39个油分含量QTL。在所定位的蛋白质含量QTL中,有5个能够在2个以上环境被定位到,这些蛋白质含量QTL分布在A1、D2、J、N和O等6个连锁群上,对表型效应的贡献率为7.65%~20.08%,其中q PC-A1-1、q PC-D2-1、q PC-J-1和q PC-O-2的贡献率在10%以上。在39个油分含量QTL中,有10个在多环境下被重复检测到,这些QTL分布在8个（A1、A2、B1、D1b、G、I、J、N）连锁群上,对表型效应的贡献率为7.30%~25.68%,其中q OC-A2-1、q OC-B1-1、q OC-G-1和q OC-J-1的贡献率在10%以上。

一个大豆脱水胁迫响应的bHLH类转录因子的克隆及功能分析

为了获得植物在干旱胁迫反应中起关键作用的基因,本研究以大豆耐旱品种和敏感品种为试验材料,利用前期构建的数字基因表达谱,从中筛选出一个在两种材料间存在表达差异的基因,命名为GmbHLH25。采用实时定量PCR对表达谱的结果进行验证,并克隆得到该基因的全长序列。利用ExPASy的ProtParam工具分析发现GmbHLH25蛋白长度为368aa,含有由50aa组成的保守结构域bHLH。进化树分析表明GmbHLH25蛋白与百脉根、苜蓿中的同源蛋白关系最近,处于同一进化分枝。洋葱表皮亚细胞定位结果表明该蛋白在细胞核中表达。PCR和RT-PCR检测表明GmbHLH25基因已经整合到本生烟草的基因组中。在干旱、高盐胁迫下超表达GmbHLH25基因能提高烟草的耐旱、耐盐能力。本研究结果将为进一步分析该基因参与的耐旱信号传导途径,深入研究bHLH转录因子在植物耐逆反应中的分子机理奠定基础。

SSR标记辅助回交转育大豆7S球蛋白α-亚基致敏蛋白缺失新品系

为快速培育7S球蛋白致敏蛋白α-亚基缺失的优质大豆新品系,以(α'+α)-亚基双缺失型材料日B为供体亲本,东农47为受体亲本,以杂交-回交转育方法为基础,结合SSR标记辅助遗传背景选择与主要农艺性状鉴定及品质分析,在BC2F4选育到7S球蛋白α-亚基缺失新品系Cb80。Cb80综合农艺性状优良,遗传背景回复率大于90%,其蛋白质及氨基酸总量为44.1%、41.95%,分别比轮回亲本东农47提高3.5和3.76个百分点。

大豆分子标记研究新进展

随着功能基因组学和高通量测序技术的发展和应用,以分子标记辅助选择育种和转基因育种为主要手段的生物育种技术越来越引起大豆育种家的重视。特别是伴随着新技术手段(如e QTL分析、GWAS分析、RNA-seq等)的发展,分子标记和QTL研究越来越趋向于高通量新标记开发、QTL精细定位以及新分析方法的应用等方面,进而推动了优质、多抗大豆新品种的培育,加快了大豆育种进程。为此,就2013年国内外大豆分子标记技术及其应用研究进展进行综述。

轮回选择创新高蛋白质含量大豆种质资源

以蛋白质含量较高的D95-753-754、克辐9807-2、黑生101、克辐05-1480为亲本材料,在田间先以产量性状、农艺性状为主要指标优先择优,在室内再以蛋白质含量为指标进行二次择优的选择方法,主要经过三轮杂交、选择和鉴定,逐轮进行蛋白质含量、熟期、百粒重等农艺、产量、品质性状的协同优化,实现了这些性状的同步改良;各轮次育成的品系蛋白质含量不断提高,与主栽品种的产量差距不断缩小,提高了育成的新种质克交11-1615和克交11-1669的育种利用价值。在研究的过程中,坚持不同育种方法获得的中间材料和每一轮次杂交优选出的中间材料的持续利用,聚合了不同来源亲本高蛋白基因;利用基因的加性效应,部分组合实现了超亲遗传。创新了高蛋白育种方法和选择策略。选育出了生育日数115 d(克山)、蛋白质含量46.5%(高于多个亲本)、百粒重19 g大豆新品种质克交11-1615和生育日数105 d(克山)、蛋白质含量44.5%、百粒重20 g的大豆新种质克交11-1669。

致敏蛋白α亚基缺失型大豆氨基酸组成及营养评价

结合模糊识别方法评价的数学模型法和联合国粮农组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organiz ation/World Health Organization,FAO/WHO）、鸡蛋蛋白两种模式下的化学分析法评价两个致敏蛋白α亚基缺失型大豆蛋白质氨基酸营养价值,解析α亚基缺失特性对大豆氨基酸组分及营养品质的影响。用氨基酸分析仪测定氨基酸的组分和含量,α亚基缺失特性用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）确认,蛋白和脂肪含量用Perten 8620近红外谷物分析仪测定。结果表明：1）致敏蛋白α亚基缺失型大豆的氨基酸总量、必需氨基酸总量、蛋白质、油分含量不因α亚基的缺失而降低;2）致敏蛋白α亚基缺失型大豆的11S/7S比值在4.65以上,高于目前普遍报道的2.0~3.0;3）致敏蛋白α亚基缺失型大豆必需氨基酸含量接近或高于FAO/WHO标准;两种模式下,α亚基缺失型大豆的5种化学评分及贴进度值都很高,接近标准蛋白。致敏蛋白α亚基缺失型大豆蛋白质氨基酸组分平衡,11S/7S比值更优,营养品质更高。

大豆GmGBP1-i植株开花后光周期反应及农艺性状分析

大豆是典型短日照植物,对光周期反应敏感。利用GmGBP1-i干涉植株与光周期反应敏感的大豆品种DN50为试验材料,通过短日照和长日照两种不同条件光周期处理,明确不同基因型大豆植株开花后光周期反应敏感性,同时分析其农艺性状。结果表明,不同光照条件下,GmGBP1干涉大豆植株均表现为植株矮小、节间距缩短、不同程度减产,且光周期反应敏感度较野生型低。说明GmGBP1基因在大豆生长、发育和生殖过程中具有重要作用。

大豆蛋白和油分含量的QTL分析

以东农47和PI317334-B杂交衍生的136个F4∶8代重组自交系（RILs）为对象,对其蛋白和油分含量进行正态分布检验及分析,同时利用182个SSR标记构建遗传图谱,并定位分别与大豆蛋白和油分含量相关的QTL,为深入改良及培育优质的大豆新品种提供了重要依据。结果表明：RILs在蛋白与油分含量的表型上的变异系数较大,分离程度好,且基本上呈正态分布;共检测到9个QTL,其中与蛋白含量相关的QTL有3个,分别位于N、C1和B2染色体上的标记SSR03_0428、SSR04_1192和SSR14_1153附近,贡献率范围为7%~8%;与油分含量相关的QTL有6个,分别位于C2、B1、B2、D2、G和I染色体上的标记SSR06_1630、SSR11_0460、SSR14_0395、SSR17_0721、SSR18_0278和SSR20_0273附近,贡献率变化范围为7%~43%。

转GmGT-2B基因大豆的耐盐性分析

采用盆栽试验方法,苗期在盐胁迫条件下,比较GmGT-2B转基因大豆与非转基因大豆的损伤程度、超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)、脯氨酸和K^+、Na^+含量以及基因表达量变化差异。结果表明:盐胁迫对转基因大豆叶片的伤害程度明显低于对照;SOD活性、脯氨酸含量、丙二醛(MDA)含量在盐胁迫5 d后均与对照有显著或极显著差异;植株的Na^+含量随盐胁迫时间的增加而升高,在胁迫第8天转基因大豆的Na^+含量达到对照约2倍;转基因大豆的基因的表达量呈上调趋势,在第8天达到表达高峰。基因表达量的变化趋势与生理指标SOD活性、脯氨酸含量和Na^+含量表现的一致。结果表明GmGT-2B基因与盐应答反应有关,其中转GmGT-2B大豆株系N11和N24盐害程度较低,该基因和转GmGT-2B基因大豆具有较大的应用价值。

离体叶片接种法鉴定大豆疫霉根腐病抗病性

[目的]探讨离体叶片接种法鉴定野生大豆抗病性的准确性和可靠性。[方法]利用24份栽培大豆对离体叶片接种法和下胚轴伤口接种法的可行性进行考察,并利用离体叶片接种法对177份黑龙江省采集的野生大豆资源进行了抗病性鉴定。[结果]离体叶片接种法与下胚轴接种法之间的相关呈极显著,且2种方法差异不显著,证明了离体叶片接种法进行大豆疫霉根腐病抗性鉴定同样准确可行。通过离体叶片接种法对177份黑龙江省采集的野生大豆资源的抗病性鉴定,获得27份抗病材料。[结论]离体叶片接种法操作简单,适合野生大豆抗病性鉴定。

大豆GmMP基因的功能预测及表达分析

通过在大豆基因组数据库中检索拟南芥AtMP(ARF5)在大豆中的同源基因,获得了GmMP基因序列。对GmMP基因编码的氨基酸序列及启动子序列进行生物信息学分析,结果表明:GmMP基因CDS序列全长2 802 bp,编码933个氨基酸。GmMP编码的蛋白为疏水性蛋白。结构域分析表明:GmMP含有B3和AUXIN RESPONSE FACTOR结构域,同时该基因是ARF家族的成员。GmMP预测的启动子区域含有与激素、胁迫、光应答、生物钟调控和转录因子结合相关的顺式作用元件。系统进化分析表明MP在豆科植物进化过程中比较保守。组织特异性表达分析结果显示GmMP在叶片中表达量最低,在茎尖中表达量最高,推测其可能参与生长素的代谢途径。

大豆四向重组自交群体单株产量QTL单标记分析

以（垦丰14×垦丰15）×（黑农48×垦丰19）衍生的含160个株系的大豆四向重组自交系群体为试验材料，应用154个SSR标记鉴定个体基因型，利用单标记分析方法，对2013和2014年在哈尔滨和克山两地4个环境下的单株产量进行QTL定位分析。结果显示：共检测到46个与单株产量相关的QTL位点，主要分布在A1、A2、C1、C2、D2、D1b、L、K、B2、N、E、J、F、G和H连锁群上，遗传率为0.15%~9.37%。遗传率较高的标记位点有BARCSOYSSR_02_0607、BARCSOYSSR_03_1620、BARCSOYSSR_19-0451、Sat_153、Sat_367、Satt229和Satt529，优异等位基因型为BARCSOYSSR_02_0607（Q1Q1）、BARCSOYSSR_03_1620（Q2Q2）、BARCSOYSSR_09_0183（Q1Q1）、Satt229（Q2Q2）、Sat_367（Q3Q3）、Satt338（Q1Q1）、Satt229（Q1Q1）和Satt668（Q1Q1）。在检测的标记位点中，BARCSOYSSR_08_0966、Sat_36、Sat_153、BARCSOYSSR_02_0607和Satt529在两个环境中重复检测，表明这5个QTL可用于分子设计育种改良单株产量。

大豆光周期效应GmGBP1基因启动子多态性分析

GmGBP1基因是植物开花途径中的重要基因,其启动子也受到短日照条件的强烈诱导。但是目前大豆GmGBP1基因启动子序列的多态性变异以及其与开花期的关系还不清楚。本试验对开花习性不同的36份大豆种质资源的GmGBP1基因启动子序列进行了克隆测序,发掘了GmGBP1基因启动子序列的自然等位变异,探讨了GmGBP1基因启动子序列的自然变异与开花期的关系。研究结果表明,多态性位点SNP-796与开花期密切相关,其中SNP-796G为缩短大豆生育时期的优异等位变异。主要的3个单倍型与开花期也表现出极显著(P<0.01)的相关性,单倍型2和单倍型3为缩短大豆花期的优异单倍型。

大豆GmGBP1启动子受激素和外源环境诱导的研究

采用PCR方法克隆大豆光周期GmGBP1基因启动子,构建含有GmGBP1启动子驱动报告基因GUS的融合性表达载体pBI121-pGmGBP1::GUS,通过花序浸泡法,转化野生型拟南芥获得pBI121-pGmGBP1::GUS转基因植株,对T3代转基因拟南芥进行GUS染色,研究了GmGBP1启动子受激素和外源环境诱导的表达规律。结果表明:大豆GmGBP1启动子受水杨酸(SA)和干旱(PEG)以及高温等外源环境的诱导,与生物信息学预测GmGBP1启动子序列存在的逆境胁迫响应元件的结果相一致。