羊痘病毒P32蛋白基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

应用PCR方法扩增羊痘病毒特异性蛋白P32蛋白的基因 ,将其克隆至pMD18_T载体 ,测定核酸序列后将P32基因克隆至Bac_to_Bac○R杆状病毒表达系统中转移载体pFastBac1和pFastBacHTa ,进而转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中 ,获得两种携带P32基因的重组转染质粒 :Bacmid_Bac1_P32 ,Bacmid_BacHT_P32 ,经PCR试验鉴定 ,获得的这两种重组转染质粒是携带P32基因的杆状病毒表达载体 。

羊痘病毒P32蛋白的表达

将已获得的 Bac- Bac1- P32、Bac- Bac HT- P32重组杆状病毒表达载体转染 sf9昆虫细胞 ,得到含羊痘病毒 P32基因的重组杆状病毒 r Bac HT- P32。将 P32基因插入到大肠杆菌表达载体 p ET30 a中 ,转化 BL 2 1感受态细胞 ,IPTG诱导表达。经 SDS-PAGE、Western- blot鉴定 ,在杆状病毒、大肠杆菌中都得到了 35 k Da重组 P32蛋白。