牛eIF5基因原核表达与蛋白纯化

研究应用PCR方法扩增牛e IF5基因编码序列,通过Eco RⅠ和SalⅠ酶切位点将其定向插入p GEX-4T-1载体,构建原核表达重组质粒p GEX-4T-1-e IF5,并转化大肠埃希菌BL21。酶切和测序鉴定正确后,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)大量诱导表达,利用GST-Sepharose 4B亲和珠纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定。结果表明,原核表达载体p GEX-4T-1-e IF5构建成功,Western Blot证实融合蛋白大量表达,纯化后获得GSTe IF5融合蛋白,为深入研究牛e IF5蛋白功能奠定基础。

牛NF-κB1基因的原核表达与蛋白纯化

NF-κB1是一类重要核转录因子,参与多种基因表达调控。NF-κB1能与奶牛乳腺中乳合成调控相关基因结合,发挥泌乳调节作用。研究应用PCR方法扩增奶牛NF-κB1基因编码序列,通过Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入p GEX-4T-1载体中,构建原核表达重组质粒p GEX-4T-1-NF-κB1,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)。经酶切和测序鉴定正确后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)大量诱导表达,8 mol·L^(-1)尿素裂解包涵体,裂解后上清经GST-Sepharose 4B亲和纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果表明,原核表达载体p GEX-4T-1-NF-κB1构建成功,SDS-PAGE证实NF-κB1融合蛋白存在于包涵体内,纯化后得到GST-NF-κB1融合蛋白,为进一步研究NF-κB1蛋白在奶牛泌乳中作用提供试验依据。

基于FemAB基因特异引物的动物双歧杆菌PCR检测方法的建立

分离和鉴定了两株双歧杆菌,通过16SrDNA通用引物扩增条带测序和非特异引物随机扩增法扩增条带测序推测其为动物双歧杆菌。随后使用以编码肽聚糖肽桥形成蛋白(Peptidoglycan bridge formation protein)FemAB基因为目的扩增片段设计的特异引物进行了扩增鉴定。结果表明,此特异引物对这两株动物双歧杆菌菌株扩增结果为阳性,其他对照菌株扩增结果为阴性,且扩增条带测序结果与预计一致。FemAB基因在PCR特异扩增法鉴定细菌种属中具有较好的分辨能力,并使用其建立了动物双歧杆菌PCR检测方法。本研究旨为应用FamAB基因鉴定细菌种属以及双歧杆菌属微生物的鉴定提供了数据参考。

SNAT2介导蛋氨酸对牛乳腺上皮细胞增殖与自噬的调节作用

钠离子依赖性中性氨基酸转运体2(SNAT2)是一种氨基酸转运蛋白,可转运中性氨基酸,广泛分布于多种细胞中。氨基酸既可作为蛋白质合成的底物,也是调节细胞新陈代谢的关键信号分子,但SNAT2是否介导氨基酸调节BMECs增殖和自噬尚未见报道。本研究利用CASY细胞计数和Western blotting技术检测SNAT2过表达和siRNA干扰后牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖情况以及SNAT2对自噬标志蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ表达量的影响,并利用免疫荧光检测细胞自噬斑点(LC3-Ⅱ)变化。结果显示,SNAT2过表达时,p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量增加,反之,p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量下降。SNAT2抑制时,LC3-Ⅱ表达量增加,免疫荧光检测自噬斑点增多。添加自噬增强剂海藻糖(trehalose,Tre)和蛋氨酸(methionine,Met)后,与单一添加Tre组相比,Met+Tre组p-mTOR表达量增加,LC3-Ⅱ表达量降低,胞浆内绿色自噬斑点减少;添加Tre和Met并抑制SNAT2时,p-mTOR表达量下降,LC3-Ⅱ表达量增多,胞浆内绿色自噬斑点增加。以上结果表明,SNAT2可介导Met通过调控PI3K-mTOR/Cyclin D1信号通路调节BMECs的增殖与自噬。

昆明小鼠乳腺不同发育时期Hex蛋白的免疫组织化学定位

为了研究昆明小鼠乳腺发育4个时期即青春期、妊娠期、泌乳期和退化期的同源异型盒基因(Hex)蛋白表达规律及组织定位,试验采用免疫组织化学法进行检测。结果表明:昆明小鼠乳腺组织结构呈周期性变化,青春期至妊娠期Hex蛋白逐渐增加,泌乳期达到高峰,退化期逐渐下降至类似青春期水平;Hex蛋白主要定位于细胞质中,泌乳期在细胞核中也有少部分出现;昆明小鼠乳腺发育的4个阶段均有Hex蛋白表达,且与乳腺周期性的变化一致。说明Hex蛋白参与乳腺的发育和泌乳调控过程。