微载体规模化培养MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的研究

目的探索H9N2亚型禽流感病毒株(A/Chiken/NX/9/99)在微载体大规模培养的MDCK细胞中的增殖规律,确定最佳增殖条件。方法将H9N2亚型禽流感病毒株接种到生长在24孔培养板上的MDCK细胞中进行增殖试验,检测接种不同感染剂量病毒、添加不同浓度TPCK-胰酶、在不同pH值的培养液中培养,接毒后不同时间的病毒血凝素滴度(HA)。根据最佳增殖条件将病毒接种至生长在微载体上的MDCK细胞中,利用250 mL和5L转瓶逐级进行大规模增殖。结果最佳病毒增殖条件为TPCK-胰酶终浓度为10μg/mL,接毒剂量为MOI=0.025,培养液pH值为7.4,在此条件下,H9N2亚型禽流感病毒株(A/Chiken/NX/9/99)适应在250 mL和5L转瓶中微载体培养的MDCK细胞内大量增殖,病毒的最高血凝价均可达到9log2(1∶512)。结论本研究为以哺乳动物细胞为基质规模化生产禽流感疫苗奠定了基础。

氮素调控对寒地玉米氮素吸收与叶片SPAD值影响的初探

由于氮肥分配比例和施用时期不当,以及没有确定氮肥追肥时期的量化指标等原因,造成了氮肥利用率较低。试验通过对玉米进行氮素(追肥时期、追肥量)的优化,研究不同叶龄期玉米叶片叶绿素(SPAD值)及氮素积累动态的变化规律,确定玉米追肥时期的叶绿素阈值,对玉米进行调控和优化定量施肥。结果表明,玉米最佳追氮时期为十叶期,在此时期,玉米穗位叶SPAD值虽然逐渐降低,但上位叶在抽雄期达到最大,然后下降。玉米全株氮素积累逐渐增加。在十叶期追氮,高氮处理(150 kg/hm2)玉米的产量最高。

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因突变对病毒体外复制的影响

为了进一步了解影响鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制效率和致病力的分子基础,作者在序列分析的基础上,利用反向遗传操作技术,针对VP2上2个重要的氨基酸位点(222和279),修饰和拯救了相应的2株突变病毒,并研究了突变病毒在体内外的生物学特性。复制动力学数据显示,VP2的222位由酪氨酸突变为脯氨酸可将IBDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的复制滴度提高6倍以上,而279位氨基酸对病毒复制效率无显著影响。SPF鸡的感染试验显示,222位和279位氨基酸与IBDV的致病力没有关系。本研究首次报道了VP2 222位和279位氨基酸与IBDV复制效率和致病力的关系,有助于更加全面地了解IBDV的基因功能,也将为新型IBDV疫苗的设计提供依据和思路。

我国高致病性猪蓝耳病病毒的演化分析

自2006年以来,我国大面积暴发高致病性猪蓝耳病,但目前对其病原HP-PRRSV的起源还不得而知。本试验通过对多株HP-PRRSV进行全长基因组分析,发现HP-PRRSV中存在4处缺失,而且这4处缺失是逐步形成的,在中间过渡类型的毒株中存在着缺失1处、2处、3处的毒株。此外,中间过渡类型毒株中的一些氨基酸基序也是逐步变化的。本试验初步阐明了我国HP-PRRSV的起源是CH-1a-like PRRSV,在中间过渡的毒株中能够发现逐步演变的轨迹。

鸭肠炎病毒VP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

应用截短表达的鸭肠炎病毒(DEV)VP5-C蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合及筛选,获得4株稳定分泌抗VP5蛋白的杂交瘤细胞株,命名为1B5、3A1、4F9、6F6。抗体亚类鉴定表明,4株单克隆抗体均为IgG、k链。间接免疫荧光检测结果表明,4株单克隆抗体均能够与DEV感染CEF发生特异性反应,而不与CEF对照发生反应。Western blot检测,4株单克隆抗体均能够识别大小约为150kDa的蛋白,说明4株单抗隆抗体是特异性识别VP5蛋白的抗体。DEV VP5蛋白单克隆抗体的制备为进一步鉴定VP5蛋白B细胞抗原表位及VP5蛋白功能研究提供了有效工具。

H5亚型禽流感病毒HA基因昆虫／杆状病毒系统的表达及对BALB/c小鼠的免疫保护

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1／96 H5N1亚型1．7kb HA基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T中并测序。亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacA的蜜蜂蜂毒素分泌信号下游中,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTM DNA)共转染Sf9昆虫细胞。将重组杆状病毒感染HFive细胞,72h左右收获细胞,超声波裂解,SDS—PAGE结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得表达。蛋白胶薄层扫描分析显示:表达的HA蛋白占重组杆状病毒感染细胞总蛋白含量的17．1％。Western-blot 及血凝实验结果显示,表达的禽流感H5N1亚型病毒HA蛋白具有生物学活性。表达的H5 HA蛋白定量乳化后,皮下多点注射免疫SPF 级BALB/c雌性小鼠,免疫后产生了H5 HA特异抗体,并在三免前后达到并保持较高水平。用致死剂量的HPAIV H5N1攻击小鼠,免疫组小鼠提供了100％的保护力,而对照组小鼠先后发病且死亡:为研制禽流感H5N1亚型病毒亚单位疫苗,防制禽流感奠定了基础。

一株丁草胺降解菌的分离鉴定及其降解特性的研究

利用富集培养技术从长期施用丁草胺的稻田土壤中分离得到能够降解丁草胺的细菌1株,标记为LYC-1。经形态特征、生理生化特征和16SrRNA序列分析,将该菌株鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter sp.),菌株LYC-1的最适生长温度为30°C,最适pH值为7.5。当接种量为5%时,该菌株在含100mg/L的丁草胺无机盐基础培养液中培养7d后,可使丁草胺降解达80%以上。