星星草(Puccinellia tenuifolra)铵转运蛋白(PutAMT)及N、C末端缺失对NH_4^+吸收能力的影响

铵是植物吸收利用的主要氮源之一,NH4+的吸收主要通过铵转运蛋白(AMT)进行运输。本研究克隆了星星草铵转运蛋白(PutAMT),以GFP为标记构建了植物表达载体,观察表明PutAMT蛋白明显定位于质膜,但是根据观察发现PutAMT蛋白的定位具有复杂性及多样性的特点。为了深入了解铵转运蛋白的结构对NH4+吸收能力的影响,构建了N、C及NC末端缺失的PutAMT(ΔNPutAMT,ΔCPutAMT及ΔNCPutAMT)的载体,转入酵母突变体菌株31019b进行NH4+吸收能力的实验,结果显示了全长PutAMT在低氮条件下具有较强的吸收NH4+的功能。N、C及NC末端缺失的突变体与全长PutAMT相比,对NH4+的吸收能力有下降的趋势。结果表明了,N、C末端对NH4+的吸收起到重要的作用。

蒙古柳金属硫蛋白的拟南芥遗传转化及抗性分析

本文研究在NaC l胁迫下筛选抗性pY ES2-蒙古柳c DNA-酵母菌,通过克隆得到蒙古柳c DNA序列,生物信息学分析该序列编码区为240 bp,编码79个氨基酸,在NCBI数据库中BLASTp分析表明和旱柳和毛果杨金属硫蛋白MT2序列有较高相似性。把克隆得到的cD NA与pB I121质粒通过Bam HI和XhoI进行酶切连接,通过农杆菌的介导法转入拟南芥。用Kana筛选的抗性苗提取基因组DNA,PCR鉴定得到6株转基因株系。将转基因拟南芥和野生型拟南芥在不同逆境下进行抗性分析,结果表明转基因拟南芥在NaC l、NaH CO3、H2O2、CuC l2、ZnC l2、CdC l2和Sorbitol胁迫培养基中表现出比对照强的抗性,其中在CdC l2培养基中比野生型植株表现出强的抗性。

蒙古柳cDNA转化酵母菌及NaCl胁迫抗性基因筛选

为挖掘蒙古柳的NaCl胁迫相关基因,本研究利用FOX hunting system技术,构建蒙古柳cDNA连接pYES2载体后转入酵母InVSCI菌株。本研究将pYES2-蒙古柳cDNA酵母菌在1.0 mol/L Na 抗性板胁迫处理后得到15个抗NaCl胁迫的酵母菌株,并利用这15个菌株进一步通过NaHCO3、H2O2和Srobitol抗性进行分析,结果发现都表现出比对照组更强的耐胁迫性。接着对这15个菌株提取细胞DNA后克隆获得蒙古柳cDNA,在NCBI数据库中对测序得到的基因序列进行相似性比对,结果发现大部分和毛果杨基因有高的相似性,其中一些基因已有研究表明和盐胁迫相关。本研究可为挖掘可利用的耐盐基因资源提供依据。

过量表达星星草(Puccinellia tenuiflora)液泡型H^+-ATP酶c亚基基因提高转基因酵母的耐盐性

植物液泡型H+-ATP酶(V-ATPase)在次级转运与应对多种逆境胁迫中具有重要作用。本研究克隆并解析了能够生长在盐碱地上的野生星星草V-ATPase c亚基基因(Put VHA-c)的功能。本研究利用荧光蛋白(GFP)标记结合内涵体染色的方法研究了Put VHA-c蛋白在酵母细胞中的定位,并利用转基因酵母分析了Put VHA-c基因在盐胁迫中的作用。共定位实验显示Put VHA-c-GFP融合蛋白主要定位在酵母细胞的内涵体上。Northern杂交和实时定量PCR显示在星星草悬浮细胞中Put VHA-c基因的表达能够被盐胁迫所诱导。研究结果结合过表达Put VHA-c的转基因酵母具有更高的耐盐性的发现,说明Put VHA-c基因参与着盐胁迫的应答。

马蔺(Iris lactea)液泡型H^+-ATP酶c亚基蛋白的原核表达与纯化

液泡型H+-ATP酶(V-ATPase)是植物生长、发育及应对逆境胁迫的关键酶,全酶由13种不同亚基组成,而V-ATPase c亚基(VHA-c)是分子量为16 k D的高度保守的脂质蛋白,对V-ATPase全酶的组装和活性具有重要作用。本研究中,利用RT-PCR方法从马蔺(Iris lactea)中克隆出Irl VHA-c基因全长读码框,将其构建到原核表达载体pGEX上并在大肠杆菌BL21中诱导表达。结果发现在0.1 mmol/L的IPTG终浓度下诱导8hGST-IrlVHA-c融合蛋白高效表达,并利用层析方法纯化获得了GST-IrlVHA-c融合蛋白,进一步为研究IrlVHA-c蛋白的结构与功能提供帮助。