电纺漏斗网蜘蛛丝纤维性能及体外细胞生物学性能

目的:近年来,蜘蛛丝在基因识别、人工合成以及基因表达上取得的成果,引发了广大研究者模拟天然蜘蛛丝优秀性能的兴趣。采用静电纺技术对制备的漏斗网蜘蛛丝再生纤维膜进行性能检测,为静电纺蜘蛛丝纳米纤维应用于组织工程和生物医学领域提供前期研究。方法:实验于2006-07/2007-03在东华大学生物研究所生物材料室完成。采用电纺技术制备了漏斗网蛛丝再生纤维膜,对纤维膜的表面形态分析,水解性能,热性能,力学性能进行检测。体外与猪动脉内皮细胞共培养,采用MTT法检测对纤维膜细胞的增殖活性,以相差显微镜和扫描电镜观察细胞的形态变化。结果:再生蛛丝纤维膜热分解起始温度为279℃;在单轴拉伸时断裂强度和断裂伸长率分别为(3.61±0.18)MPa和(33.20±4.86)%;内皮细胞能够在纤维表面黏附并显示良好的生长形态;MTT结果显示内皮细胞在材料上增殖活跃,培养7d后,纤维膜上的细胞增殖为对照组的两倍多。结论:漏斗网蜘蛛丝再生纤维膜显示出稳定的热性能和高的延展性,并能有效促进内皮细胞的黏附和增殖,具有良好的生物相容性。

丝素蛋白和乳酸-己内酯共聚物纳米纤维支架构建组织工程化角膜上皮的实验研究

目的评估兔角膜缘上皮细胞在丝素蛋白(SF)和乳酸-己内酯共聚物(PLCL)复合纳米纤维薄膜上的黏附、增殖和分化情况,探讨SF-PLCL复合纳米纤维薄膜作为组织工程角膜上皮支架材料的可行性。方法利用六氟异丙醇(HFIP)作为溶剂,配制浓度为8%的SF和PLCL共混物(质量比25∶75)的纺丝溶液。通过静电纺丝技术制备纳米纤维膜。将体外培养的第一代兔角膜缘上皮细胞种植于SF-PLCL纳米纤维薄膜上进行复合培养。利用扫描电镜观察SF-PLCL纳米纤维薄膜的表面形态及细胞材料复合物的表面形貌;利用免疫荧光染色分析角膜上皮细胞标记物K3的表达情况;通过细胞活力检测观察细胞在材料上的生长分布规律。结果 SF-PLCL纳米纤维薄膜的平均纤维直径为(715±186)nm,材料具有较好的透明度。扫描电镜显示角膜缘上皮细胞在材料上保持正常上皮细胞的铺路石样形态,黏附生长良好,细胞表面布满微绒毛,细胞间紧密联接;免疫荧光染色表明角膜缘上皮细胞在材料上可分化为成熟的角膜上皮细胞。细胞活力检测证实角膜缘上皮细胞在材料上生长良好,均匀分布,形成多层层化结构。结论角膜上皮细胞与SF-PLCL纳米纤维膜的生物相容性良好,SF-PLCL纳米纤维膜是一种潜在、合适的组织工程角膜上皮支架材料。

静电纺壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维的细胞相容性

目的:静电纺是一种使带电荷的聚合物溶液或熔体在静电场中射流来制备聚合物纳米级纤维的加工方法,采用此种技术制备壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维,并观察其细胞相容性。方法:实验于2006-11/2007-10在东华大学化学化工与生物工程学院生物材料与组织工程实验室完成。①支架材料制备:以六氟异丙醇/三氟乙酸为溶剂体系,采用静电纺制备复合纳米纤维,其中壳聚糖/胶原蛋白的质量比分别为100∶0,80∶20,50∶50,20∶80与0∶100。②细胞相容性观察:体外接种猪髋动脉内皮细胞,苏木精-伊红染色法观察细胞形态,MTT法检测细胞黏附和增殖情况。结果:猪髋动脉内皮细胞在壳聚糖/胶原蛋白复合纤维表面贴附牢固,外形饱满,多呈长梭形,具有良好的生长形态;MTT法结果显示纳米纤维能够有效地促进内皮细胞在材料表面的黏附和增殖,质量比为20∶80材料组细胞黏附、增殖能力最强,其次为50∶50组。结论:静电纺壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维具有良好的细胞相容性,可望成为一种新型的组织工程支架材料。

羊毛蛋白酶减量细化的研究

用不同的方法对羊毛进行细化处理,考查了不同蛋白酶制剂、不同处理条件对羊毛细度、减量率、强度的影响。实验表明:碱性蛋白酶对羊毛纤维的减量效果比酸性蛋白酶要好,用蛋白酶与氧化剂同时对羊毛纤维进行处理,在取得较好减量效果时,也对羊毛纤维造成较大损伤,在进行酶处理前,用保护剂对羊毛纤维进行预处理,可以降低羊毛纤维的强力损失。

聚己内酯/壳聚糖与聚己内酯/聚乳酸支架与人脂肪来源干细胞的生物相容性研究

目的 对比人脂肪来源干细胞（Human adipose derived stem cells,hADSCs）与聚己内酯/聚乳酸（Polycaprolactone/Polylactide,PCL/PLA）和聚己内酯/壳聚糖（Polycaprolactone/chitosan,PCL/CS）复合支架的生物相容性,为进一步体内组织修复提供依据.方法 体外分离、培养和扩增hADSCs,分别制备PCL/PLA、PCL/CS复合支架,扫描电镜观察支架材料的表面情况.取材料浸提液培养hADSCs,CCK-8法检测细胞活力,评价支架的细胞毒性.hADSCs传代扩增后,接种到支架材料上,裸鼠皮下培养2周,HE染色观察细胞在支架上的生长情况.结果 hADSCs与成纤维细胞相似,呈“梭形”,并以集落形式生长.扫描电镜观察PCL/CS孔径在100μm左右,孔隙率为88.76％,而PCL/PLA支架孔径则在40μm左右,孔隙率为91.45％.hADSCs在PCL/CS浸提液中培养1、3、7天的相对增殖率分别为98.6％、101.6％、110.3％,而PCL/PLA组为98.1％、100.7％、108.4％,说明hADSCs在两种浸提液中均保持较高的增殖率,即两种合成支架均无细胞毒性.hADSCs复合两种支架体内培养后,HE染色后可见有大量细胞长入PCL/CS支架内部,同时免疫组化HLA-Ⅰ检测发现,支架材料内部分细胞阳性表达,说明PCL/CS支架内该部分的细胞来源于人,即hADSCs.而在PCL/PLA内部渗透进入的细胞不如PCL/CS支架组.结论 PCL/CS和PCL/PLA支架安全无毒,hADSCs在PCL/CS支架上显示更好的细胞相容性,该支架可以作为hADSCs的载体材料,用于组织工程膀胱修复的研究.

聚左乳酸己内酯-胶原蛋白静电纺人工血管的降解研究

探讨聚左旋乳酸己内酯-胶原蛋白构建的可降解人工血管材料的降解规律以及生物相容性.聚左旋乳酸己内酯-胶原蛋白混合溶液通过静电纺丝技术制成静电纺人工血管材料作为实验组（n=40）,市售聚四氟乙烯人工血管材料作为对照组（n=40）,分别植入兔背部脊柱两侧肌肉,于术后10、30、90、180 d取材,行形态学、组织学观察;并在400倍光学显微镜视野下进行中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的分类计数.结果镜下聚左旋乳酸己内酯胶原蛋白组材料周围组织炎症反应轻,术后90 d材料碎裂,纤维组织长入材料网孔间隙内,逐步取代材料部位,形成囊状纤维膜;术后180 d材料基本降解殆尽,植入区域组织重塑后形态接近正常组织.聚四氟乙烯组材料周围组织炎症反应轻,术后180 d仍基本保持原有结构,材料周围有薄层纤维组织膜包绕.细胞计数结果提示植入后不同时期两组材料引起的细胞反应类型和反应趋势相同;仅术后10 d时实验组中性粒细胞数量较对照组增多（224.4±37.2 vs 192.2±18.1个/0.25 mm2,P ＜0.05）,其余两组各期各类细胞均无明显差异（P＞0.05）.实验材料降解时间为3～6月,具有生物相容性好、降解规律适宜的良好生物学性能,有作为血管替代物的潜在可能性.

应用石墨烯改良PLCL/Gel纳米纱支架材料的可行性分析

目的探索应用石墨烯(Gr)改良聚-L-丙交酯-己内酯/明胶(PLCL/Gel)纳米纱支架材料的可行性。方法采用自制的静电纺丝装置分别制备PLCL-Gel和Gr-PLCL-Gel水纺纳米纱支架材料。使用体视显微镜、扫描电子显微镜观察支架材料形态结构;通过拉伸试验观察该材料机械强度;采用CCK-8实验评价支架生物相容性,并将支架植入大鼠皮下,观察细胞浸润情况。结果拉伸试验显示,加入石墨烯可明显提高支架的力学性能。两组支架都无明显细胞毒性,在体内外实验中均表现出良好的生物相容性,体内实验表明石墨烯在一定程度上减轻了炎症反应。结论应用石墨烯改良PLCL/Gel纳米纱支架材料,可以获得具有合适力学性能、亲水性、生物相容性的纳米纱支架材料,在组织工程皮肤等方面具有应用潜能。

Split Inteins介导的多肽链两端标记

多肽链多位点特异性标记有助于了解蛋白质的结构与功能,特别是在蛋白质的动态构象研究方面.但是,现有的多肽链多位点特异性标记方法各有局限性,并且种类有限,所以有必要开发新的多肽链多位点特异性标记方法以满足研究需求.本文以Diub(ubiquitin dimer)蛋白为研究对象,借助S1和S11型2种不同的断裂蛋白质内含子(split inteins)的蛋白质反式剪接,将含有不同荧光基团的两种小肽成功剪接至靶蛋白的两端,最终达到对靶蛋白的末端标记目的.

一种具降压活性的新型血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂研究

目的:对一种新型的血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(R1)进行降压活性评价。方法:采用125I标记血管紧张素Ⅱ进行受体结合试验来检测化合物对血管紧张素Ⅱ受体的亲和力;采用无创尾动脉测压法检测R1在自发性高血压大鼠体内的降压活性。结果:受试化合物R1对血管紧张素Ⅱ具有很高的亲和性,其IC50值为1.17±0.32n M,在动物体内显示出高效、长效的降压活性,最大降压值达到43.22±6.86mm Hg。

一种沙坦类降压新化合物的药理活性研究

目的对一种新型的血管紧张素II受体拮抗剂进行降压活性评价。方法采用放射性受体结合试验研究化合物对血管紧张素II受体的亲和性;采用无创尾动脉测压法进行动物体内降压活性研究。结果受试化合物对血管紧张素II具有很好的亲和性,其IC50值为3.55±0.11 n M,在动物体内显示出高效、长效的降压活性,最大降压值超过40 mm Hg。

树状大分子修饰纳米金颗粒作为CT分子探针的可行性初步研究

目的 研究树状大分子修饰纳米金颗粒作为CT分子探针的可行性.方法 将第5代聚酰胺胺树状大分子修饰的纳米金颗粒（Au DENPs）配制成15种浓度（0.001～0.1 mol/L）的悬液为实验组,相同浓度的非离子型碘造影剂（Omnipaque）为对照组,离体CT扫描比较相同浓度Au DENPs与Omnipaque的CT值差异.根据离体实验结果将6种浓度（0.006～0.02 mol/L）的Au DENPs 10 μl注射至BALB/C小鼠背部皮下行microCT扫描,观察其显影效果.结果 （1）离体实验发现当浓度≤0.01mol/L时,Au DENPs的CT值略低于相同浓度的非离子碘造影剂;当浓度〉0.02mol/L时,Au DENPs的CT值高于相同浓度的非离子碘造影剂.（2）动物体内显像实验证实,当浓度≥0.009 mol/L时,经mieroCT成像可以清晰的显示注入小鼠皮下软组织的Au DENPs,而浓度≤0.008 mol/L时,注入小鼠体内的Au DENPs未被检出.结论 Au DENPs具有比现有CT造影剂更优秀的固有显影特性,具备成为CT分子探针的首要条件.

水鲨头皮胶原蛋白分离及其部分特性研究

目的从水鲨头皮分离得到胶原蛋白并研究其部分生化特性。方法水鲨头皮用不同浓度的氢氧化钠溶胀,去离子水清洗至中性,经胃蛋白酶限制性酶解,离心,上清液经透析后冷冻干燥,得到胶原蛋白制品。用聚丙烯酰胺凝胶电泳、差式扫描量热仪(DSC)、圆二色谱仪等研究了分离得到的胶原蛋白的特性。结果胶原蛋白的回收率为鲜重的2.9%～4.1%;在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)上呈现清晰的3条谱带,相对分子质量分别为205 000、134 000、118 000,热变性温度为69℃。结论分离得到的胶原蛋白可进一步用于微囊剂、纳米材料等生化材料的研究。

温和条件下分离马胶鲨皮胶原蛋白的方法及其部分特性研究

目的探讨分离马胶鲨皮胶原蛋白的方法以及马胶鲨皮胶原蛋白的部分生物化学特性。方法马胶鲨皮经清洗、浸泡、匀浆、离心得上清液。沉淀重复上述的提取过程,合并上清液,加硫酸铵沉淀胶原蛋白,回收的沉淀溶于磷酸盐缓冲液,经葡聚糖凝胶过滤后,蛋白溶出液被冷冻干燥。用聚丙烯酰胺凝胶电泳法、差示扫描量热仪法、圆二色谱仪法表征了通过上述磷酸盐缓冲液溶胀分离法获得的胶原蛋白的特性。结果用磷酸盐缓冲液溶胀分离法从马胶鲨皮分离得到胶原蛋白,胶原蛋白的回收率为鲜重的3.2%～3.4%;分离的胶原蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现清晰的三条谱带,分子质量分别为205 000、134 000、118 000;马胶鲨皮胶原蛋白的最高热变性温度为47℃;分离的马胶鲨皮胶原蛋白在空间结构上以β-折叠为主,并包含有大量的无规卷曲。结论本研究所制备的高纯度胶原蛋白可用于生物医学材料的进一步研究。

分子内烯炔复分解反应研究进展

烯炔复分解反应涉及碳-碳双键和叁键的断裂及重组生成1,3-二烯烃化合物.分子内的烯炔复分解反应已成为合成各种环状化合物的有用方法.主要介绍了分子内烯炔复分解反应的机理,催化剂以及Ru卡宾催化的烯炔复分解反应在有机合成中的应用.

丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯纳米纤维支架对兔腱-骨愈合影响的实验研究

目的探讨丝素蛋白(silk fibroin,SF)/聚乳酸-聚己内酯[poly(L-lactic acid-co-e-caprolactone),P(LLA-CL)]纳米纤维支架对兔腱-骨愈合的影响。方法通过静电纺丝技术制备SF/P(LLA-CL)纳米纤维支架,扫描电镜观察材料形貌;并将支架与小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1复合培养1、3、5 d,扫描电镜观察细胞黏附、增殖情况。取24只新西兰大白兔随机分为两组(n=12),对照组采用自体肌腱、实验组采用SF/P(LLACL)纤维纳米支架包裹自体肌腱建立关节外模型;术后6、12周采用组织学和生物力学测试评价腱-骨愈合情况。结果 SF/P(LLA-CL)纳米纤维支架为非取向结构,纤维直径为(219.4±66.5)nm;复合培养后,MC3T3-E1细胞在支架上生长良好,并随时间延长细胞逐渐增多。组织学观察示,术后6周两组腱-骨界面均有炎性细胞浸润,界面宽度未见明显差异;12周时实验组腱-骨界面可见新骨长入,而对照组无新骨长入。生物力学测试,术后6周,两组失效负荷及刚度比较差异均无统计学意义(P>0.05);12周时实验组失效负荷及刚度均显著高于对照组(P<0.05)。结论 SF/P(LLA-CL)纳米纤维支架具有较好的细胞相容性,能有效促进兔腱-骨愈合,为临床上ACL重建移植物的改良提供新思路。