电纺胶原和蛛丝纳米纤维膜的制备、表征及生物安全性比较

目的:制备胶原和蜘蛛丝两种纳米纤维膜,进行理化性能表征和生物相容性比较,以期将蜘蛛丝纳米纤维用于组织工程支架材料。方法:实验于2006-07/2007-08在上海市东华大学生物科学与技术研究所完成。将胶原和蜘蛛丝分别以80g/L溶于六氟异丙醇,采用高15kV压静电纺制成纳米纤维膜,真空干燥后对其理化性能进行表征。扫描电镜观察超微结构,并进行水接触角测量和水解稳定性测量;并采用MTT实验比较猪大动脉内皮细胞在两种纤维膜表面的黏附、生长和增殖等情况。结果:①静电纺胶原和蛛丝纳米纤维膜均具有良好三维多孔结构,但蛛丝纤维直径更均匀。蛛丝膜具有较大的水接触角,在水解稳定性测试中质量损失较少。②MTT实验表明,种植6h后血管内皮细胞在胶原和蛛丝膜上都能黏附,但蛛丝膜上细胞增殖速度较快,2d后超过胶原膜,7d后蛛丝膜上细胞多于胶原膜表面40%以上。结论:胶原和蛛丝都能促进血管内皮细胞黏附、生长。蛛丝膜具有较强的疏水性和水解稳定性,在体外培养过程中蛛丝更有利于细胞增殖,有望作为血管组织工程支架材料。

同轴静电纺丝法制备神经生长因子纳米纤维缓释载体

背景:传统的缓释药物的制备过程,常需要把蛋白质类药物与有机溶剂混合,降低了蛋白质的活性,同轴静电纺丝法减少了蛋白质与有机溶剂的接触,有望提高蛋白质的活性,提供新型的缓释载体。目的:探讨应用同轴静电纺丝技术制备蛋白质类药物神经生长因子"壳-芯"结构纳米纤维缓释载体的可行性。设计、时间及地点:对比细胞学实验,于2007-07/12在东华大学生物科学与技术研究所完成。材料:乳酸己内酯共聚物(50∶50,Mw=378,839g/mol,Mw/Mn=2.7324)由东华大学生物科学与技术研究所提供;β-神经生长因子为R&D Systems公司产品;牛血清白蛋白为Sigma-Aldrich公司产品;大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞由中国科学院细胞库提供。方法:应用同轴静电纺丝技术制备以乳酸己内酯共聚物为壳,神经生长因子和牛血清蛋白为芯的复合纳米纤维;然后进行体外缓释8周,将不同时间点缓释液加入到无血清RPMI培养基中,培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)。根据芯层溶液流速的不同分为0.10,0.15,0.25mL/h3组纳米纤维。主要观察指标:通过扫描电镜和透射电镜对纳米纤维形貌特征进行表征,应用图像分析软件Image-J计算纳米纤维的直径分布范围;PC12细胞在神经生长因子的诱导下可以向神经元细胞分化,通过观测其分化率检测神经生长因子的生物活性。结果:成功制备了具有壳芯结构的乳酸己内酯共聚物/牛血清蛋白/神经生长因子纳米纤维,纳米纤维的平均直径和直径分布范围随着芯层溶液流速的增加而增大。当芯层溶液流速为0.10mL/h时或0.15mL/h,纺丝稳定,所得纤维平均直径较小,直径分布范围较窄,当芯层溶液流速为0.25mL/h,纺丝不稳定,有大量"串珠"出现。在各个时间点乳酸己内酯共聚物/牛血清蛋白/神经生长因子缓释上清液能够诱导PC12细胞分化神经元细胞,生长轴突,说明神经生长因子保持了一定程度的生物活性至少8周。结论:应用同轴静电纺丝技术可制备蛋白质类药物神经生长因子"壳-芯"结构纳米纤维缓释载体。

小肠黏膜下层粘接交联制作小口径血管支架

目的:探讨将小肠黏膜下层粘接交联制作小口径血管支架的可行性。方法:实验于2006-04/12在上海交通大学附属第六人民医院中心实验室和四肢显微外科研究所完成。①实验材料:小肠黏膜下层膜按Abraham法制备;清洁级雄性新西兰大白兔24只,2.8～3.2kg。②实验过程:以胶原蛋白-硫酸软骨素共混溶液将猪小肠黏膜下层膜粘接成小口径(内径3.0mm)管型支架,并用碳化二亚胺交联,得到粘接交联小肠黏膜下层管。取24只兔,手术造成颈总动脉缺损,随机平分为2组,对照组采用缝制小肠黏膜下层管桥接修复缺损;实验组采用粘接交联小肠黏膜下层管桥接修复缺损。③实验评估:通过爆破压测定检测支架的粘接强度、通过体外溶血试验和细胞毒性试验检测支架的生物相容性;于术后1,2周和1,2个月做血管彩色多普勒超声检测其通畅性;以组织学苏木精-伊红染色、Masson染色观察组织生长情况,评价支架的血液相容性和组织再生能力。结果:①粘接交联的小肠黏膜下层血管支架爆破压:在湿润状态的爆破压可达22.1kPa;溶血率为1.4%;细胞毒性评级为0～1级。②支架溶血率和细胞毒性:体外溶血及细胞毒性试验均表明碳化二亚胺交联小肠黏膜下层管具有良好的生物相容性,完全符合医用生物材料的应用要求。③植入兔体内后支架通畅性和组织学表现:植入替代兔颈总动脉缺损后2个月,粘接交联支架的通畅率为83.3%(10/12),明显高于缝制支架的33.3%(4/12)(P<0.05);在通畅血管中动脉瘤样扩张的发生率,缝制支架为100%(4/4),粘接交联支架仅为20%(2/10)。所有通畅的血管在术后1个月时均有完整平滑的内膜形成和平滑肌细胞长入;2个月时平滑肌细胞增多,小肠黏膜下层的胶原纤维也明显减少;无炎症反应、血管破裂发生。结论:粘接交联法可用于小肠黏膜下层小口径血管支架的制作,可保持支架的良好生物相容性并改善血管重建过程中小肠黏膜下层的力学性质,从而显著提高小肠黏膜下层用于修复小口径血管缺损的成功率。

肝素化纳米材料P(LLA-CL)的制备及其表征和抗凝血性特征

目的:采用等离子体技术引发表面接枝肝素方法,使纳米材料P(LLA-CL)表面肝素化,以提高材料的抗凝血性。方法:制备静电纺高聚物P(LLA-CL)纳米纤维,采用等离子体技术引发纳米材料P(LLA-CL)表面肝素化,对其表面进行改性,并测试其力学性能,同时对肝素化材料进行了接触角测试观察其表面亲水性,傅里叶全反射红外光谱分析进行表面分析,扫描电镜观察纤维形态,EDS能谱对表面元素组成进行表征,血液相容性实验评价肝素化P(LLA-CL)材料表面的血液相容性。结果:采用等离子体技术能够成功将肝素接枝到P(LLA-CL)表面。等离子体处理后P(LLA-CL)材料表面接触角显著减小,亲水性增强;等离子引发肝素化后,材料仍能保持良好的机械力学性能;红外光谱、扫描电镜和EDS结果表明等离子体引发肝素成功接枝到P(LLA-CL)表面;血液相容性实验显示肝素化材料复钙时间全血凝血时间明显延长。结论:材料在等离子体肝素化改性处理后抗凝血性能改善,血液相容性提高。