糖基化终末产物促进大鼠血管平滑肌细胞钙化

目的观察糖基化终末产物对体外培养的血管平滑肌细胞钙化的影响。方法在含10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠培养液中加入不同浓度(0、50、100、200 mg/L和400 mg/L)的糖基化终末产物与大鼠血管平滑肌细胞孵育不同时间。采用磷酸苯二钠法检测碱性磷酸酶活性,甲-酚酞络合酮方法测定钙含量,实时定量逆转录聚合酶链反应检测成骨细胞特异性核心结合因子、碱性磷酸酶以及骨桥蛋白基因表达,蛋白免疫印迹检测成骨细胞特异性核心结合因子及骨桥蛋白蛋白表达。结果与对照组相比,糖基化终末产物随作用时间延长和浓度增加,细胞钙含量增加(P<0.05),升高碱性磷酸酶活性和基因表达(P<0.05),促进成骨细胞特异性核心结合因子及骨桥蛋白基因及蛋白表达(P<0.01)。结论糖基化终末产物可促进体外培养的大鼠血管平滑肌细胞钙化。

噬菌体展示技术生物淘选CTGF表位的研究

噬菌体展示技术筛选缔组织生长因子(CTGF,connective tissue growth factors)蛋白表位。用含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液干预人肾小球系膜细胞2 d后,提取CTGF天然蛋白,应用Western blot-ting方法鉴定CTGF单克隆抗体的特异性;以CTGF单克隆抗体为筛选工具,对噬菌体随机12肽库进行筛选,逐步增加选择压力,经过3轮筛选后随机挑取4个克隆测序,用竞争抑制和间接ELISA方法检测噬菌体阳性克隆的特异性。Western blotting分析显示,CTGF单克隆抗体能与CTGF天然蛋白及重组蛋白特异性结合。噬菌体文库经过3轮筛选后得到的阳性克隆,测序结果表明4个克隆的序列高度一致,推导获得小肽序列,命名为ZD521;竞争抑制和间接ELISA分析与预期结果一致。本研究用噬菌体展示技术成功获得与CTGF单抗高度结合的小肽,为CTGF功能研究以及进一步以该肽为疫苗预防和治疗纤维化疾病打下基础。

人源结缔组织生长因子单链可变区抗体片段的筛选

目的:从人源单链可变区片段(ScFv)文库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆,获得ScFv氨基酸序列。方法:以重组硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白为靶目标,用差异吸附法,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取8个克隆,提取DNA后测序;测序阳性的DNA转化E.coliHB2151,IPTG诱导后用间接ELISA方法检测培养上清单链抗体的活性。MTT法测定单链抗体对CTGF促人近曲肾小管上皮HK-2细胞增殖作用的影响。结果:从8个克隆中获得7个完全一致的DNA序列(W0616);另有1个克隆丢失了重链,且轻链框架区(FR)和互补决定区(CDR)序列与W0616不一致;阳性克隆经诱导后,培养上清用间接ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.001)。同时,该单链抗体片段能明显抑制CTGF引起的HK-2细胞的增殖。结论:成功获得与CTGF特异结合的人源单链抗体可变区序列,为CTGF抑制剂的研究奠定基础。

十二肽库中与结缔组织生长因子特异结合噬菌体的筛选

目的:从随机十二肽库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆。方法:用基因重组方法制备硫氧化还原蛋白(TrxA)以及硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白;噬菌体肽库经TrxA预吸附后,与TrxA-CTGF结合,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取10个克隆,提取单链DNA后测序;用直接和间接ELISA方法检测噬菌体阳性克隆与CTGF结合的特异性。结果:10个克隆中8个DNA序列完全一致(810A),另有2个有不同序列(810B,810C);3个阳性克隆用直接和间接ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.05)。结论:成功获得与CTGF特异结合的噬菌体克隆,为CTGF小分子抑制剂的研究打下基础。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ对糖基化终产物诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用

目的观察吡格列酮对糖基化终产物(AGEs)刺激下大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的作用及对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因及蛋白表达水平的影响,探讨PPARγ在AGEs诱导VSMCs增殖中的作用。方法(1)MTT法观察不同浓度、不同时间的AGEs对VSMCs增殖的影响及吡格列酮(1.0、10、100μmol/L)与AGEs共孵育对VSMCs增殖的干预作用。(2)用半定量逆转录聚合酶链反应测定VSMCs中PPARγmRNA的表达。(3)用Western blot法检测PPARγ的蛋白表达。结果AGEs作用导致VSMCs增殖,AGEs抑制PPARγmRNA和蛋白表达水平,这种抑制作用随着AGEs干预的时间延长和浓度的增加而增强(P<0.05)。PPARγ激活剂吡格列酮通过增加PPARγ的表达,抑制AGEs诱导的VSMCs增殖。结论PPARγ表达的下降可能是糖尿病易患动脉粥样硬化的重要原因之一。