戊型肝炎病毒Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ基因型B细胞抗原表位的异同

目的 :制备戊型肝炎病毒 (HEV)缅甸株和墨西哥株ORF2重组蛋白 (p16 6Bur和p16 6Mex)的单克隆抗体(McAbs) ,用于分析HEV不同基因型B细胞抗原表位的特点。方法 :将免疫BALB C小鼠脾细胞与SP2 0骨髓瘤细胞融合 ,获得分泌抗 p16 6Bur和抗 p16 6MexMcAbs的杂交瘤细胞株 ,然后采用ELISA和免疫印迹法测定McAbs与不同基因型HEVORF2编码蛋白p16 6的免疫反应性。结果 :获得 4株杂交瘤细胞株 ,即分泌抗 p16 6BurMcAbs的 2C2 、2B1 以及分泌抗 p16 6MexMcAbs的D8G1 0 和E5E1 2 ,其中 2B1 分泌的McAb仅能与第Ⅰ、Ⅱ基因型编码的重组蛋白结合 ,而其余 3株分泌的McAbs既能与I、II基因型HEV的p16 6重组蛋白发生反应 ,也能与III、IV基因型的p16 6蛋白反应。结论 :HEV第Ⅰ、Ⅱ基因型与Ⅲ、Ⅳ基因型ORF2编码蛋白既有共同又有不同的B细胞抗原表位。

戊型肝炎病毒第4基因型中国株ORF2编码蛋白的抗原表位分析

以戊型肝炎病毒（HEV）第4基因型中国株ORF2编码蛋白p166Chn制备单克隆抗体（McAbs）,同时制备20个N端或C端逐渐截短的p166Chn截短蛋白,与7种不同基因型和亚型的p166蛋白一起,通过ELISA、免疫印迹（Western blot）以及竞争抑制实验对主要存在于我国的HEV第4基因型毒株进行抗原表位分析。结果发现所制备的McAbs与p166Chn截短蛋白的免疫反应有两种类型,以1G10为代表的McAbs能与N端不短于aa477、C端不短于aa613的截短蛋白反应,其针对的抗原表位是构象依赖型表位,依赖于aa477-aa613肽链区段;而McAb2F11则能与N端不短于aa474、C端不短于aa617的截短蛋白反应,其针对的抗原表位也是构象表位,但需依赖于较长的肽链区段（aa474-aa617）。竞争抑制实验显示两类McAbs互不抑制,进一步证实了所发现的两个抗原表位在空间位置上的不同。更有意义的是,两类McAbs均能与其他不同HEV基因型和亚型来源的p166重组蛋白发生阳性反应,表明这两个抗原表位是HEV基因型共同性的,可以在世界各国分布的不同基因型HEV毒株中诱导交叉免疫。

PKH26标记UMSC示踪技术在细胞移植治疗卵巢癌中的应用

目的:探讨PKH26荧光染料作为脐血间充质干细胞(UMSC)示踪剂在移植治疗卵巢癌中应用的可行性。方法:从脐血单个核细胞(MNC)中培养获得传至第3代贴壁细胞,流式细胞仪(FCM)检测其表面分子表达,茜素红及油红O染色观察其向成骨、成脂细胞诱导分化状况。用PKH26标记经鉴定的UMSC,荧光显微镜观察其标记率,再用标记的2×106个UM-SC经尾静脉移植给荷卵巢癌裸鼠,14天后观察标记细胞的迁移和转归。结果:从脐血MNC培养获得传至第3代贴壁细胞,其低表达CD34和CD133而高表达CD44、CD29及CD90特征性分子,并能诱导分化为成骨、成脂细胞。经鉴定表明:从脐血MNC中可培养出UMSC。PKH26标记的UMSC呈长梭形或纺锤形,标记阳性率达98.63%。标记的UMSC在裸鼠经14天迁移后,在裸鼠脾脏及肿瘤组织中均可见发出红色荧光的标记细胞。结论:PKH26标记的UMSC可作为体内示踪细胞移植治疗卵巢癌的有效方法。

戊型肝炎病毒结构蛋白p166在家蚕细胞及蛹体中的表达

目的探讨戊型肝炎病毒结构蛋白基因片段p166(HEVp166)在家蚕/BmNPV表达载体系统中的表达水平。方法应用PCR、基因克隆及共转染等技术将p166插入到家蚕杆状病毒多角体启动子的下游,构建重组病毒;并在家蚕细胞及家蚕蛹中表达p166。用间接免疫荧光试验检测感染36h后家蚕培养细胞中p166蛋白的表达情况。收集感染后144h的蛹样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodiumdodecylsulphate-Polyacrylamidegelelectrophoreses,SDS-PAGE)及Westernblot-ting分析。结果获得含有HEVp166基因片段的重组杆状病毒表达载体Bm-HEV166。Bm-HEV166能在家蚕细胞中表达p166蛋白,感染后的培养细胞中出现绿色球状体;感染Bm-HEV166的家蚕蛹血淋巴能高效表达p166蛋白,蛹血淋巴能与抗p166单克隆抗体发生特异性反应,在Mr为19000大小的位置出现一条明显的杂交条带。结论HEVp166基因片段在家蚕蛹中能获得高效表达,为进一步研制HEV口服疫苗奠定基础。

食用乙肝疫苗的研究进展

经口传递的食用乙肝疫苗与传统的注射疫苗相比具有安全、有效、易于推广等诸多优势 ,近年来受到广泛的重视。目前利用转基因植物生产食用乙肝疫苗的研究已取得显著的进展 ,并开始应用于人的临床实验。本文综述了近年来在该领域的研究成果 ,展望了食用乙肝疫苗的良好前景。

不同基因型戊型肝炎病毒的抗原表位分析

目的 研究不同基因型戊型肝炎病毒 (HEV)的抗原表位特点。方法 以HEV基因工程重组蛋白p16 6Bur、p16 6Mex为免疫原 ,制备单克隆抗体 (McAbs)。采用间接ELISA法及免疫印迹法(Westernblot) ,检测所制备的McAbs与 7种不同基因型和亚型p16 6 (p16 6Bur、p16 6Pak、p16 6Mor、p16 6Mex、p16 6Us、p16 6Nz和p16 6Chn)的交叉反应性。结果 获得 4株稳定分泌基因型相关McAb的杂交瘤细胞株 ,即 1B5、1D1 0 、1G1 0 和D4 A3。经检测 ,1B5、1D1 0 、1G1 0 分泌的McAbs只与p16 6Bur及p16 6Mor特异结合 ,D4 A3分泌的McAb只与p16 6Mex特异结合。结论 不同基因型HEV存在不同的抗原表位。

转染IL-21的CD34^＋脐血造血干细胞抗裸鼠卵巢癌作用研究

目的探讨IL-21转染的脐血造血干细胞（CD34^＋ UBSC—IL-21）对荷卵巢癌裸鼠的治疗作用。方法从脐血分离CD34^＋造血干细胞，体外培养扩增后用于重组体pIRES2-IL-21-EGFP转染。以肿瘤大小、荷瘤鼠生存期判断CD34^＋UBSC·IL-21对荷瘤裸鼠的治疗效应。以RT—PCR、免疫荧光、ELISA、Westernblot、脾细胞增殖试验及免疫组化法分别鉴定CD34^＋UBSC和肿瘤组织中IL-21的表达及活性。裸鼠脾细胞中NK细胞含量及脾细胞的杀伤效应、血清中IFN—γ和TNF—α水平分别用FCM与ELISA检测。结果pIRES2-IL-21-EGFP成功转染CD34^＋UBSC。CD34^＋UBSC—IL-21能抑制肿瘤生长，延长荷瘤裸鼠生存期，治疗鼠肿瘤局部能表达IL-21、血清IFN-γ1和TNF-α水平升高，NK细胞含量及NK细胞杀伤活性明显增强，与其他组相比，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论转染IL-21的CD34^＋UBSC有良好的抗裸鼠卵巢癌作用，该结果为临床使用UBSC为载体的基因治疗卵巢癌研究奠定了基础。

基于PCR的乙型肝炎病毒体外中和试验

目的 建立一种新的基于PCR的乙型肝炎病毒(HBV)体外中和试验,将其用于HBV中和抗体的检测,为新型HBV疫苗的评估提供一种体外模型。方法 待检免疫血清与已知HBV作用后接种HepG2 细胞,吸附、洗涤、培养后提取细胞核酸,PCR检测HBVDNA以判断中和试验结果。结果 免疫血清与10倍最小PCR感染剂量的HBV作用后接种细胞,培养2 4h后检测表明,其中和滴度高,结果稳定。市售疫苗免疫小鼠血清、多数抗HBsELISA阳性人血清和2份含HBVS区的新型候选疫苗的免疫血清中和试验阳性,而正常小鼠血清、戊型肝炎病毒重组蛋白免疫血清和抗 HBs阴性人血清中和试验阴性。结论 基于PCR的HBV体外中和试验简单、快速、经济,具有良好的特异性和敏感性,可以用于新型HBV疫苗免疫效果的评估。