脂多糖刺激下的人肺微血管内皮细胞血管紧张素Ⅱ受体1放射受体分析法的建立

目的建立一种脂多糖（LPS）刺激下人肺微血管内皮细胞（HPMEC）血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）1型受体（ATR1）与其配体AngⅡ结合的放射配体结合分析法（RLBA）。方法体外培养的HPMEC接种于24孔培养板,当细胞达到80%-90%融合,饥饿24 h后用浓度为100 ng/ml的LPS刺激8 h,用0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.62、.0 fmol 8个不同剂量的放射性配体125I-AngⅡ（TL表示其放射性）在板孔中与ATR1结合（存在或不存在5μg AngⅡ）,然后γ计数仪计数,测定ATR1的总结合（TB）与非特异性结合（NSB）,TL减去TB得游离放射配体（F）,TB减去NSB得ATR1的特异性结合（B）。由TB与TL作图得ATR1饱和曲线;由B/F与B作图得出Scatchart曲线。结果随放射性配体125I-AngⅡ加入量的增加,NSB也相应逐渐增加,且由直线相关与回归分析得到NSB与加入125I-AngⅡ剂量呈直线关系（r2=0.9929）;Scatchart作图得B/F与B也呈直线关系,其相关系数r2=0.9514。HPMEC上仅存在单一亲和力的AngⅡ受体,反应亲和力的Kd值为109 pmol/5×10^5细胞,从Scatchart曲线与X轴截距得到ATR1的最大结合位点Bmax为29 pmol/5×10^5细胞;ATR1饱和曲线分为两段,前段斜率较大,随125I-AngⅡ加入量的增加TB增加明显;后端曲线较为平坦,TB随125I-AngⅡ的增加变化不明显,125I-AngⅡ在1600 pmol/5×10^5细胞与2000 pmol/5×10^5细胞之间TB的增加与NBS增加基本相当,能使ATR1饱和的125I-AngⅡ剂量为1600 pmol/5×10^5细胞。结论本实验建立的RLBA方法能得到ATR1的Kd与Bmax两个基本参数,可用于LPS刺激下HPMEC的ATR1功能研究。