A20介导TNF-α炎症微环境下髓核细胞衰老的机制研究

目的:探讨锌指蛋白A20[也称为肿瘤坏死因子诱导蛋白3(tumor necrosis factor-induced protein 3,TNFAIP3)]在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)炎症微环境下髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)衰老发生机制。方法:体外分离培养SD大鼠髓核细胞。实验分为三组:正常对照组(只加入正常培养基)、TNF-α干预组(加入不同浓度的TNF-α,10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)和自然衰老组(在体外通过细胞不断增长传代至P20代)。应用CCK-8细胞增殖实验﹑β半乳糖苷酶染色﹑Western blot(WB)、QT-PCR、immunofluorescence(IF)从基因、蛋白及细胞功能水平评估髓核细胞衰老变化。应用WB、QT-PCR和IF检测锌指蛋白A20﹑NF-κ资B(p65)﹑NF-κB(p-p65/phospho S536)表达情况。结果:与正常对照组相比,TNF-α干预48h、72h后髓核细胞的增殖能力明显降低;TNF-α干预组和衰老组β半乳糖染色阳性率较对照组明显增高;QT-PCR结果提示,与对照组比,TNF-α干预组p53表达增加(P<0.05),而A20表达随着TNF-α浓度增高而降低;衰老组A20表达较对照组减少,而p53扩增升高。WB检测显示:TNF-α可以诱导p53﹑A20、p-p65表达上调,而A20表达随着TNF-α浓度增加而降低;同时衰老组A20表达较对照组减少,而p-p65和p53表达增加(P<0.05);IF显示:与对照组对比,TNF-α处理下A20﹑p-p65表达增加,但是A20的表达随着TNF-α增加而降低,衰老组A20较对照组也明显降低,p-p65表达增加。结论:髓核细胞衰老程度与TNF-α干预存在剂量关系,TNF-α可以刺激髓核细胞A20表达升高,并激活NF-κBB信号通路。而A20表达情况受细胞衰老程度影响,随着髓核细胞衰老A20所参与的作用效能逐渐减低。

内质网应激在酸诱导的人椎间盘髓核细胞损伤中的作用机制研究

目的 :模拟人椎间盘髓核(nucleus pulposus,NP)酸性环境,研究酸诱导的内质网应激活化以及内质网应激在酸诱导的髓核细胞损伤中的作用机制。方法:体外单层培养人正常髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)系,以p H值7.4为对照,p H值7.0和6.5分别模拟正常和退变椎间盘酸性环境,培养12~72h,建立酸诱导的髓核细胞损伤模型。采用CCK8法检测髓核细胞增殖情况,透射电镜检测髓核细胞中内质网应激活化情况,免疫荧光检测内质网应激特异性标志物糖调节蛋白78(78 k Da glucose-regulated protein,GRP78)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表达。应用4-PBA(内质网应激阻断剂)阻断内质网应激后,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;β半乳糖苷酶染色检测细胞老化。Western blot检测LC3、GATA4、p53、p21、p16、Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白变化情况。结果 :与对照组相比,酸刺激下(p H6.5组)髓核细胞整体增殖力较对照组明显下降;透射电镜下可见内质网扩张明显,膜表面积增加,内质网线粒体膜结构形成,伴线粒体肿胀;细胞免疫荧光检测提示GRP78和CHOP表达明显增加(P<0.05)。应用4-PBA后,细胞凋亡率增加,且能够显著增加酸诱导的G1期停滞及β半乳糖苷酶阳性染色率(P<0.05)。Western blot检测发现,酸刺激下,髓核细胞LC3、GATA4、p53、p21、p16、Bax和Caspase3表达增高(P<0.05),Bcl-2表达降低(P<0.05);应用4-PBA后可降低LC3比值和Bcl-2表达水平,并显著升高GATA4、p53、p21、p16、Bax和Caspase3(P<0.05)。结论:酸性微环境能够活化内质网应激,在酸诱导的人髓核细胞急性损伤中起保护作用。

复制性老化髓核细胞Hippo-Yes相关蛋白信号通路的作用机制

目的探讨Hippo-Yes相关蛋白(YAP)信号通路在复制性老化髓核细胞中的作用机制。方法取人源髓核细胞(NPCs)为研究对象,根据老化特性及慢病毒干扰载体不同进行分组,即A组:未老化第三代NPCs,B组:第十代老化NPCs,A和B两组根据转染不同的慢病毒载体shYAP或sh-Control再分两个亚组,分别是A sh-Control组,A shYAP组,B sh-Control组和B shYAP组。体外培养第三代NPCs,通过连续传代诱导建立复制性老化细胞模型(RS),细胞衰老SA-β-Gal染色检测分析老化与未老化NPCs生物学特性。慢病毒载体shYAP和sh-Control分别转染老化和未老化NPCs,检测Hippo-YAP信号通路干预情况及对下游靶基因CYR61的表达影响。最后,SA-β-Gal染色检测分析各个亚组老化与未老化NPCs生物学特性和老化率。结果B组SA-β-Gal染色显示NPCs蓝色团块数目高于A组(90.4%比15.6%,P<0.05);A组可见YAP基因和蛋白水平表达高于B组(0.77±0.12比0.31±0.04,0.52±0.06比0.12±0.05,P<0.05),免疫荧光显示YAP主要位于细胞核内(85%)。B组细胞Hippo-YAP信号通路激活,YAP及其靶基因CYR61的基因水平和蛋白水平降低,且YAP分布由核内转移至胞质内,胞质YAP比例增加(56%)。B组中两亚组细胞均显示出老化细胞特有的的外观表现,shYAP慢病毒载体转染老化NPCs后对其细胞老化率无明显影响(P>0.05)。结论Hippo-YAP信号通路参与NPCs老化的发生发展,对维持细胞的生长、增殖发挥着重要作用。