食管癌中AKT和PTEN蛋白表达及其临床相关性研究

目的:探讨食管癌组织中AKT和PTEN的表达及其临床相关性。方法:应用Western blot和免疫组织化学方法检测42例食管癌组织及其癌旁组织中AKT,FFEN蛋白的表达情况。结果:食管癌组织中,AKT蛋白水平高于癌旁组织(P<0.01),PTEN蛋白水平低于癌旁组织(P<0.01),二者呈负线形相关(r=-0.583,P<0.01)。AKT蛋白表达在Ⅲ_b-Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移的食管癌中的表达高于Ⅱ-Ⅲ_a期、高分化、无淋巴结转移的食管癌(P<0.01),而PTEN则完全相反(P<0.01)。二者的表达均与年龄、性别、肿瘤大小无关(P>0.05)。结论:AKT蛋白的高表达在食管癌的发生、发展起重要作用,而PTEN则抑制这一作用过程。

通心络通过PI-3K/Akt/HIF信号通路改善血管内皮细胞缺氧损伤

目的:观察通心络对缺氧血管内皮细胞中缺氧诱导因子(HIF)及其上游信号转导通路PI-3K/Akt的影响,探讨PI-3K/Akt/HIF信号通路在通心络改善血管内皮细胞抗缺氧损伤中的作用。方法:将体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)分为常氧对照组、通心络组、缺氧组和缺氧+通心络组。采用CCK-8试剂盒检测各组细胞的活性,Western blotting检测HIF-1α、Bcl-2、Mcl-1、Bax表达变化及Akt的磷酸化情况。利用HIF-1α的显性负性突变体(DN-HIF)瞬时转染HUVECs,流式细胞仪分析细胞的凋亡情况。利用PI-3K和Akt的显性负性突变体瞬时转染HUVECs,探讨PI-3K/Akt信号通路在通心络改善血管内皮细胞抗缺氧损伤中的作用。结果:与常氧条件下比较,通心络对缺氧内皮细胞虽有明显的促增殖作用,但程度明显减弱。通心络可显著上调HIF-1α、Bcl-2、Mcl-1蛋白表达水平及Akt磷酸化水平,且下调Bax的表达。利用DN-HIF抑制HIF-1α的活化后,通心络提高缺氧HUVECs活性的程度明显下降,但仍可一定程度上降低细胞凋亡百分率。进一步利用PI-3K显性负性突变体(Δp85)和Akt显性负性突变体(DN-Akt)阻断HIF-1α上游信号通路PI-3K/Akt后,通心络上调缺氧HUVECs HIF-1α蛋白表达的作用明显减弱,促进Akt磷酸化的作用基本消失。结论:在缺氧条件下,通心络上调HUVECs HIF-1α蛋白表达水平,促进抗凋亡因子同时抑制促凋亡因子的表达,降低细胞凋亡率,从而提高缺氧细胞的增殖率,这些作用在一定程度上依赖于PI-3K/Akt/HIF通路的活性。

不同时期小鼠胚胎整体石蜡标本的制备技术

目前研究小鼠胚胎发育国内外大多采用液氮冰冻胚胎切片方法进行,具有简便、省时、快捷等优点,但整体胚胎尤其大的胚胎切片技术要求高,胚胎切片的完整性和连续性难度大,组织结构较差,另外胚胎长期保存困难[1,2],因此我们通过不断探索,采用石蜡包埋技术制备出不同时段小鼠整体胚胎石蜡切片,结合应用原位杂交、免疫组化等实验方法,为研究小鼠胚胎发育的本质和疾病因等提供了有力的技术平台.

聚糖蛋白3在原发性肝癌病理诊断中的意义

目的:检测聚糖蛋白3(glypican-3,GPC3)在原发性肝癌组织中的表达以研究其在病理诊断中的意义。方法:应用免抗人GPC3多抗对270例石蜡切片组织以及芯片肝癌组织进行免疫组化检测。结果:正常肝组织不表达GPC3蛋白。肝癌组织中GPC3阳性率达到74.5%(182/244),肝细胞癌及肝内胆管细胞癌中GPC3阳性率分别为78.2%(176/225)、31.6%(6/ 19),有显著性差异(P<0.05),且肝细胞癌中几乎所有癌细胞均呈阳性,强度较强,但肝内胆管细胞癌中GPC3蛋白分布有限,强度较弱。GPC3蛋白在Ⅰ-Ⅱ级与Ⅲ一Ⅳ级、直径≤3 cm与>3 cm、AFP>20μg/L与AFP≤20μg/L HCC分化组织中的阳性率分别为82.9%(63/76)及75.8%(113/149)、75.4%(43/57)及79.2%(133/168)、77.5%(131/170)及80.0%(44/55),均无显著性差异。在AFP阴性小肝癌中的阳性率为71.4%(10/14),在23例复发癌组织中的阳性率高达91.3%(21/23)。结论:GPC3广泛存在于肝癌组织细胞中,可作为一种新的肿瘤标志物应用于肝癌的临床病理免疫组化诊断与鉴别诊断。

运用激光捕获显微切割对肝细胞癌与肝内胆管癌蛋白质组的分析

目的:分析肝细胞癌和肝内胆管癌蛋白质的表达差异,获取鉴别两者的分子标志物。方法:通过激光捕获显微切割技术分离肝细胞癌和肝内胆管癌的纯细胞,通过双向电泳和质谱的方法检测两者表达的差异蛋白,再通过免疫组化染色的方法证实差异蛋白表达的情况。结果:肝细胞癌和肝内胆管癌图谱分别检测到(1124±110)、(938±90)个蛋白点。分析发现78个差异蛋白点,通过质谱鉴定出28个有意义的蛋白,20个蛋白仅在肝细胞癌表达或表达明显增高,8个蛋白仅在肝内胆管癌中表达或者高表达。同时免疫组化证实BK125H2.1在肝细胞癌中表达强阳性,而肝内胆管癌中缺失表达。结论:激光捕获显微切割是蛋白质组研究中的一个突破性的技术,可以有效地解决组织异质性的问题;本实验检测到的差异蛋白例如BK125H2.1可能成为鉴别肝细胞癌与肝内胆管癌特异性的分子标记物。

丝裂霉素C对肝癌细胞中NF-κB基因表达和分布的影响

目的 :探讨丝裂霉素C(MMC)对肝癌细胞中NF κB分布和基因表达的影响。方法 :应用细胞免疫组织化学检测不同浓度的MMC对SK HEP 1细胞中NF κB分布的影响 ,Western blot检测 5 0 μg/mlMMC作用不同时间的NF κB蛋白水平 ,RT PCR方法比较 5 0 μg/mlMMC持续处理细胞不同时间和作用 2h停止用药后不同时间NF κB基因表达水平的影响。结果 :不同剂量的MMC能够不同程度地使细胞核中NF κB免疫组化染色增强 ,5 0 μg/ml的MMC导致了NF κB蛋白蛋白印迹水平升高 ,并在MMC处理 8h的细胞中升至最高 ,RT PCR方法检测NF κB基因mRNA水平在MMC持续处理的细胞中也上升 ,在第 2小水平最高 ,随后下降 ,但是在MMC处理 2h停止用药后NF κB基因mRNA水平没有下降反而继续上升 ,并持续到第 12小。结论 :MMC能够促进NF κB自细胞浆进入细胞核 ,5 0 μg/ml的MMC导致了NF κB自身表达升高并在撤除用药后仍旧存在 ,提示NF κB同细胞抗MMC活性密切相关。

spp1基因在肺癌组织中表达的定量检测及其意义

目的 :探讨定量检测骨桥蛋白编码基因在原发性肺癌中的表达及其意义。方法 :制备 2 4例肺癌患者癌及癌周正常肺组织中总RNA ,采用RT PCR及实时荧光定量PCR技术分析spp1基因的mRNA表达水平。 结果 :在所有 2 4例肺癌中肺癌组织的骨桥蛋白表达高于相邻的癌周正常肺组织 ,并且全部在 6倍以上 ,其中 7例在 10 0倍以上。结论 :肺癌组织中骨桥蛋白的表达明显升高 ,是肺癌诊断的重要标志物。

N-硝基-L-精氨酸抗阿片类精神依赖作用

目的 研究N 硝基 L 精氨酸 (NO2 Arg)在吗啡、二氢埃托啡精神依赖形成中的作用。 方法 采用小鼠腹腔注射吗啡、二氢埃托啡的方法建立小鼠精神依赖的条件性位置偏爱模型 ;采用荧光内过滤法测定小鼠脑内NO的含量 ;小鼠脑内cAMP/cGMP含量采用放射免疫法测定。结果 小鼠吗啡、二氢埃托啡精神依赖形成过程中脑内NO ,cAMP ,cGMP的含量显著上升 ;腹腔注射NO2 Arg 5mg·kg- 1 可抑制吗啡、二氢埃托啡精神依赖升高小鼠脑内NO ,cAMP ,cGMP含量的作用。结论 NO在易化阿片类药物精神依赖形成中可能有一定作用 ;NO2 Arg抑制吗啡。

条斑紫菜多糖PY-D2对4种人肿瘤细胞株生长的影响

目的:研究条斑紫菜多糖体外抗肿瘤的生物学活性。方法:应用生化技术分离和纯化条斑紫菜多糖,获得条斑紫菜多糖的2个组分,分别为PY-D1和PY-D2;在体外培养条件下分别用不同浓度的条斑紫菜多糖PY-D2处理4种人肿瘤细胞,通过MTT法观察条斑紫菜多糖PY-D2对4种人肿瘤细胞生长的影响;采用流式细胞仪检测肿瘤细胞的细胞周期变化。结果:条斑紫菜多糖PY-D2诱导HO-8910、MCF-7、K562和7721肿瘤细胞72h后,对其生长有明显的抑制作用,呈剂量依赖效应,500mg/LPY-D2的抑制率分别为21.2%、23.6%、19.8%和21%(P<0.001)。流式细胞仪检测表明PY-D2可以阻滞肿瘤细胞的细胞周期于G0/G1期或G2/M期。结论:条斑紫菜多糖PY-D2具有抑制肿瘤细胞HO-8910、MCF-7、K562和7721生长的作用,其有关的分子生物学作用机理值得进一步研究。

炎症微环境与肝癌转移

肝癌形成以及肿瘤侵袭和转移过程中癌细胞和癌旁基质之间的相互调节作为一个动态系统已被广泛研究。肝肿瘤微环境一般分为细胞成分和非细胞成分:细胞成分包括肝实质细胞、肝星状细胞、成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞、间充质干细胞;非细胞成分包括生长因子、细胞因子、细胞外基质、激素和病毒等。目前研究认为肝脏细胞成分在经历外界不同刺激后,通过促进细胞坏死、凋亡以及分泌多种蛋白形成炎症微环境,从而参与肝肿瘤的发生和发展。由于肝细胞癌引起死亡的主要原因是肿瘤的进展和转移,因此深入研究肿瘤转移过程中肝细胞与炎症微环境之间的相互作用将有助于系统性阐述肝癌转移的分子机理。

给药途径对强啡肽A_(1-13)抑制吗啡依赖大鼠戒断症状的影响

目的 研究不同给药途径对强啡肽A1 13 (Dyn)抑制吗啡依赖戒断症状的影响。方法 采用剂量递增法建立大鼠吗啡身体依赖模型 ;吗啡依赖大鼠戒断症状采用sc 5mg·kg-1纳洛酮激发 ;Dyn对吗啡依赖大鼠戒断症状的影响采用侧脑室、脊髓及静脉内注射Dyn后 ,对大鼠经纳洛酮激发后 6 0min内可数和不可数的戒断症状进行评分的方法进行。结果 静脉内注射10 0 μg·kg-1Dyn可短暂抑制戒断症状 ;髓鞘内注射 4 μg·kg-1Dyn可明显抑制绝大部分的戒断症状 ;侧脑室注射Dyn对吗啡依赖大鼠戒断症状无显著的抑制作用。

N-硝基-L-精氨酸抗吗啡、二氢埃托啡诱导小鼠位置偏爱作用(英文)

采用条件性位置偏爱模型对N 硝基 L 精氨酸 (L NNA)在吗啡、二氢埃托啡精神依赖中的作用进行了研究。L NNA 5mg·kg-1可使吗啡、二氢埃托啡精神依赖小鼠在条件性位置偏爱箱偏爱侧停留时间分别从 6 0 9± 2 0 2min ,7 98± 0 72min显著增加到 9 31± 1 10min (P <0 0 1) ,9 4 8± 1 2 1min (P <0 0 1)。小鼠皮下注射吗啡、二氢埃托啡形成精神依赖后 ,脑内NO含量升高至 (46 3 3± 18 6 )pmol·mg-1蛋白、(470 9± 16 4 )pmol·mg-1蛋白 ,显著高于生理盐水组的 (40 7 9± 15 6 )pmol·mg-1蛋白水平 (P <0 0 1)。而连续协同给予L NNA 5mg·kg-1三天后 ,吗啡、二氢埃托啡精神依赖小鼠脑内NO的含量分别降低至 (40 3 5± 17 2 )pmol·mg-1蛋白 (P <0 0 1) ,(412 2± 2 3 8)pmol·mg-1蛋白 (P <0 0 1) ,显著低于给予L NNA前的水平。与生理盐水组小鼠水平无显著性差异。我们的结果表明 :L NNA可逆转吗啡、二氢埃托啡所致的精神依赖 ,L

N-硝基-L-精氨酸抑制大鼠吗啡身体依赖的强啡肽机制

目的 研究N 硝基 L 精氨酸 (NO2 Arg)在抑制吗啡身体依赖形成中的作用及探讨强啡肽在该过程中的可能作用。方法 采用剂量递增皮下注射吗啡法建立大鼠吗啡身体依赖模型 ;身体依赖程度采用皮下注射 5mg·kg-1 纳洛酮激发戒断症状并对大鼠 6 0min内可数和不可数的戒断症状评分的方法进行 ;采用放射免疫法分别测定大鼠脑各分区、垂体、脊髓和血浆内免疫活性强啡肽A(ir-Dyn)的含量。结果 NO2 Arg可剂量相关性地抑制吗啡身体依赖的形成 ,其中 5mg·kg-1 NO2 Arg可显著抑制吗啡依赖大鼠大多数戒断症状 ;NO2 Arg处理可显著升高吗啡依赖大鼠脊髓、纹状体、垂体及血浆内ir-Dyn的水平。该作用可被特异性κ -受体阻滞剂norbinaltorphimine (nor-BNI)所拮抗。结论 NO2 Arg剂量相关性地抑制吗啡身体依赖的形成 。

牛初乳免疫球蛋白 A的纯化与原子力显微镜观测

目的 :纯化牛初乳免疫球蛋白 A(Ig A)并在原子力显微镜 (AFM)下进行观测。 方法 :应用逐级盐析、透析和离子交换层析等生化手段 ,从牛初乳中提取 Ig A,SDS- PAGE鉴定纯化结果。应用 AFM对吸附在新剥离云母或多聚赖氨酸 (PL L)处理云母片基上的 Ig A进行空气相的结构观测。 结果 :考马斯亮蓝染色鉴定纯化的蛋白含有重链、轻链和分泌片 ;正常生理条件下的 Ig A以寡聚体结构为主 ,单体大约 2 .6 nm× 1 8.0 nm× 2 0 .2 nm,与电镜结果基本吻合 ;Ig A在 PL L 处理云母片基上的吸附呈现树枝状聚集 ,随孵育时间的延长 ,聚集现象更趋明显。 结论 :结合生化方法和 AFM观测 ,可对 Ig A等免疫球蛋白分子进行天然结构状态的微观探测 。

Cystatin B在肝癌组织中的表达及其与患者预后的关联

目的:研究Cystatin B(CSTB)在肝癌组织中的表达及其与肝癌患者预后的相关性。方法:利用Realtime PCR和Wester n blot分别检测肝癌病人癌与癌旁组织中CSTB m R NA水平和蛋白的表达,进一步通过免疫组织化学法检测组织芯片中CSTB表达并分析其与肝癌临床特征的关系。采用KaplanMeier生存分析法分析CSTB与肝癌预后的关系。结果:在肝癌组织中CSTB m RNA水平和蛋白水平的表达明显高于癌旁(P<0.05);生存分析发现CSTB高表达肝癌患者比低表达的患者更易复发且总体生存期短(P值均小于0.05);CSTB的表达与年龄、性别、BCLC分级以及肿瘤大小差异均无统计学意义(P值均大于0.05),CSTB高表达的患者更容易形成门脉癌栓(P<0.05)。结论:CSTB在肝细胞癌组织中高表达,其表达水平与肝癌病人预后有关,有望成为肝癌预后指标。

肝癌患者血清中聚糖蛋白3检测的临床意义

目的探讨血清聚糖蛋白3（GPC3）在肝癌研究中的临床应用价值。方法应用生物素-链霉亲和素系统亲和力高的特点建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，检测681份不同人群血清中的GPC3。结果（1）肝硬化组（42．9％）、肝癌组（41．4％）、肝癌复发组（61．1％）患者血清GPC3阳性率与正常人组（4．1％）及乙肝组（8．6％）差异有统计学意义（P〈0．01）；肝细胞型肝癌组（HCC）血清GPC3阳性率（45．9％）高于胆管细胞型肝癌组（ICC）（20．9％）（P〈0．05）；HCC组中直径≤3cm的小肝癌及AFP≤20μ/L的肝癌血清中GPC3阳性率分别为36．0％、41．9％；AFP≤20μg／L且直径≤3cm的小肝癌患者血清GPC3阳性率为44．4％（4／9）。（2）联合血清AFP及GPC3，可将单独应用AFP时提示肝癌复发从77．7％提高N88．9％。（3）结肠癌肝转移病例血清中GPC3的阳性率为28．6％。（4）手术切除术前及术后2-16d内HCC患者血清中GPC3的变化多样。（5）24例HCC组织GPC3阳性20例，其中血清GPC3阳性率为50％。结论血清中GPC3的测定作为一种新的肿瘤标志物在肝癌的诊断特别是早期诊断、提示复发、转移及评价手术治疗效果中可能均有一定的意义。

聚糖蛋白抗体的制备及其在肝癌组织及细胞系蛋白表达检测中的应用

目的制备聚糖蛋白3（glypican-3，GPC3）抗体并应用其对肝癌组织及细胞系中GPC3蛋白表达进行研究，探讨GPC3蛋白作为肝癌潜在的新的肿瘤标志物的可能性。方法利用原核表达系统诱导表达了GPC3抗原并制备了特异性好的兔抗GPC3多克隆抗体，应用该纯化的抗体对40例组织（正常肝7例，肝细胞型肝癌26例，胆管细胞型肝癌7例）及4个细胞系（肝癌细胞系HepG2、HUH-7、Hep3B，非肝癌细胞系Hela）进行了蛋白印记杂交试验。结果Westernblot结果显示，肝癌组织及肝癌细胞系HepG2、HUH-7、Hep3B细胞系中有相对相对分子质量约70000的蛋白主带，与GPC3的核心蛋白带相对分子质量大小相一致；正常肝组织不表达GPC3蛋白，肝细胞型肝癌中癌组织（HCC）及癌旁组织表达GPC3蛋白的比例分别为84．6％（22／26）及30．8％（8／26），7例胆管细胞型肝癌（ICC）中有2例癌组织及其旁组织表达GPC3。结论GPC3蛋白广泛存在于肝癌组织中，很可能成为一种新的肝癌肿瘤标志物。

两种人脐带间充质干细胞源外泌体分离方法的比较

目的探索人脐带间充质干细胞(hUMSCs)来源的外泌体的最佳分离条件并对其进行生物学鉴定。方法无血清培养法培养hUMSCs,培养上清中收集外泌体,超高速离心法(ult-exo)和沉淀法分离外泌体(pri-exo),Western Blot检测外泌体标志性蛋白CD63、HSP70、HSP90和阴性对照蛋白TAPA1,透射电镜观察分离所得外泌体生物学形态,高清晰质谱分析外泌体包裹蛋白种类。结果无血清培养法能够在不改变细胞生物学形态的条件下获取hUMSCs源外泌体,透射电镜下可见超高速离心可以获得具有典型双层膜结构的外泌体,大小在100 nm左右,而沉淀法分离所得产物不具有典型的外泌体形态表征,大小在30 nm左右;Western Blot结果表明超高速离心法所得外泌体CD63、HSP70、HSP90均呈现阳性,阴性对照蛋白TAPA1呈现阴性,沉淀法只能检测到HSP90;高清晰质谱检测出超高速离心法分离所得外泌体有169种蛋白,沉淀法有102种,共有蛋白79种。结论超高速离心法和沉淀法所得外泌体在蛋白标志物、生物学形态和内含蛋白种类均有差别,本实验结果提示分离hUMSCs源外泌体超高速离心法优于沉淀法。