携带IL-18的溶瘤腺病毒的构建及对肝癌细胞的体外实验

目的:构建端粒酶启动子和缺氧启动子调控的增殖腺病毒CNHK600-IL-18,观察其在肝癌细胞中的增殖能力和对肝癌细胞的杀伤作用。方法:TCID50法检测pSG600和CNHK600-IL-18在3种不同细胞内96 h的增殖情况。MTT法检测pSG600和CNHK600-IL-18在不同MOI条件下对3种细胞的杀伤情况。用CNHK600-IL-18感染BJ细胞,收集上清液,测其诱导T细胞产生的INF-γ量。结果:Western印迹结果显示,CNHK600-IL-18感染SMMC-7721细胞后能检测出IL-18表达。CNHK600-IL-18感染BJ细胞后,其上清液能诱导T细胞产生INF-γ。CNHK600-IL-18在BEL-7404和SMMC-7721细胞中96 h增殖倍数分别是31 658和125 396,分别是在BJ细胞中增殖的400倍和1 587倍。结论:CNHK600-IL-18能特异地在肝癌细胞中增殖并产生具有生物活性的IL-18,对肝癌细胞有明显的杀伤作用。

基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin治疗肝癌的实验研究

目的 探讨一种新的基因 病毒治疗系统CNHK30 0 murineendostatin(简称CNHK30 0 mE)对肝癌的治疗作用。方法 利用基因重组技术构建一种用人端粒酶逆转录酶 (hTERT)启动子控制腺病毒E1A基因表达并携带内皮抑素基因的基因 病毒治疗系统 ;通过 5 0 %组织培养感染剂量 (TCID5 0 )方法和细胞活性检测法四氮唑盐比色试验 (MTT法 )观察CNHK30 0 mE在 2种肝癌细胞株 (HepGII及Hep3B)及 1株正常的成纤维细胞株 (MRC 5 )中的病毒增殖能力和对细胞的杀灭能力 ;通过肝癌SMMC772 1细胞裸鼠皮下移植瘤模型观察该病毒对肝癌生长和对肿瘤血管生成的抑制作用 ;利用Western印迹法和酶联免疫吸附实验 (ELISA)法检测内皮抑素基因在体内和体外的表达。结果分别感染肝癌细胞株和正常细胞株 96h后病毒的增殖倍数相差 32 96倍 ,其达到半数杀伤量 (ED50 )时的感染复数 (MOI)值相差 2 5倍 ,差异有显著意义 ,且两者均明显优于ONYX 0 15 ;CNHK30 0 mE能明显抑制肝癌皮下移植瘤内血管的生成 ,对肿瘤生长的抑制作用与携带同一治疗基因的非增殖型腺病毒和不携带治疗基因的增殖型腺病毒ONYX 0 15相比均增强 (P均 <0 0 1) ;其所介导的内皮抑素基因在体内和体外的表达量均与携带该基因的非增殖型腺病毒载体相比均增高 (P <0 0

新型的病毒-基因治疗系统CNHK500-hγ的构建

目的研制出一种新的基因-病毒治疗系统。方法通过基因操作技术将主要晚期启动子(MLP)调控的人干扰素-γ基因插入腺病毒E1A基因受hTERT启动子调控、E1B基因受HRE启动子调控的增殖病毒载体质粒PXC70-HRE-TP的E1A上游,得到腺病毒质粒pSG500-hγ。通过pSG500-hγ与质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK500-hγ。用TCID50方法测定病毒滴度。通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力。利用ELISA法检测人干扰素-γ抗癌基因的表达。结果CNHK500-hγ的病毒滴度为4×109pfu/ml,增殖实验结果证实CNHK500-hγ可以选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中增殖,CNHK500-hγ所携带的人干扰素-γ基因在肝癌细胞株中的表达量(442μg/L)明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体(120μg/L)Ad-hγ(P<0.005)。结论CNHK500-hγ是一种具备治疗肝癌潜力的新型基因-病毒治疗系统。

基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin的构建及体外研究

目的构建一种新型的肿瘤基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin(CNHK300-mE),以肿瘤增殖病毒为载体,携带抗肿瘤新生血管生成的基因。方法利用基因重组技术将人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子插入腺病毒E1A基因上游,将小鼠内皮抑素基因表达盒插入到腺病毒包装信号和hTERT启动子之间,通过病毒增殖试验、电镜技术、Western blot分析、酶联免疫吸附实验(ELISA)、鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验,观察CNHK300-mE的复制情况、mE的表达情况及对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制情况。结果成功构建了基因-病毒治疗系统CNHK300-mE,该系统为hTERT启动子调控腺病毒E1A基因表达并携带小鼠内皮抑素基因的重组腺病毒。该病毒可以在端粒酶阳性的胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株HepGII中大量增殖及复制,而在端粒酶阴性的正常纤维细胞中不增殖。电镜证实该重组病毒在胃癌细胞株SGC-7901中复制及增殖。ELISA检测表明SGC-7901感染CNHK300-mE后7d,小鼠内皮抑素的表达量为1000μg/L。CAM实验证实该病毒感染胃癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论基因-病毒治疗系统CNHK300-mE能在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性增殖复制,并大量表达具有抗新生血管生成生物活性的小鼠内皮抑素。