携带hIFN-γ的增殖型腺病毒治疗胃癌的体外实验研究

目的:研究增殖型腺病毒CNHK300-hIFN-γ在胃癌细胞中的增殖、杀伤能力与表达hIFN-γ蛋白的能力。方法:病毒增殖实验比较CNHK300-hIFN-γ与CNHK300在胃癌细胞SGC-7901与成纤维细胞BJ中的增殖能力;ELISA法比较CNHK300-hIFN-γ和复制缺陷型腺病毒Ad-hIFN-γ在细胞中hIFN-γ蛋白的表达量;细胞活力MTT检测法与CPE实验观察CNHK300-hIFN-γ对胃癌细胞与正常细胞的杀伤效应。结果:增殖实验结果表明CNHK300-hIFN-γ能选择性地在端粒酶阳性的胃癌细胞中大量增殖;ELISA实验结果表明CNHK300-hIFN-γ在胃癌细胞中hIFN-γ的表达量可至117.26±15.92ng/ml;MTT与CPE实验表明CNHK300-hIFN-γ对胃癌细胞有显著的杀伤性,对正常细胞无明显杀伤。结论:增殖型腺病毒CNHK300-hIFN-γ感染胃癌细胞后增殖活跃并能大量表达目的基因hIFN-γ,对胃癌细胞有明显杀伤作用但对正常细胞无明显杀伤,为胃癌的病毒基因治疗进一步提供了理论依据。

携带IL-24的溶瘤腺病毒作用于乳腺癌的体外实验研究

目的构建携带IL-24基因的溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24,评估CNHK600-IL-24在体外对乳腺癌细胞的杀伤能力。方法将IL-24基因插入腺病毒穿梭载体SG502-ΔCR2,与5型腺病毒骨架载体pPE3共转染至人胚肾293细胞,获得溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24。荧光显微镜观测及病毒体外增殖实验测评病毒在乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常成纤维细胞MRC-5中的增殖情况;MTT法检测不同MOI值的病毒对两种细胞的抑制效应;ELISA法检测病毒感染细胞后上清液中IL-24的含量;Western blot法检测细胞内的IL-24蛋白;流式细胞检测细胞的凋亡情况。结果 CNHK600-IL-24经测序及PCR鉴定,病毒滴度为1.9×1010pfu/mL。CNHK600-IL-24感染MDA-MB-231细胞后表现出强大的增殖、复制能力,而在MRC-5细胞内增殖并不明显;CNHK600-IL-24在很低的浓度就能对MDA-MB-231细胞产生明显的杀伤效应,而对MRC-5细胞的杀伤作用明显减弱;CNHK600-IL-24感染MDA-MB-231细胞后,IL-24蛋白的表达明显增多,而感染MRC-5细胞后产生的IL-24维持在很低的水平。流式细胞检测发现,病毒引起的MDA-MB-231细胞明显凋亡而MRC-5细胞的凋亡率很低。结论本研究成功构建高滴度的溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24,该病毒具有在乳腺癌细胞中特异性增殖并杀伤肿瘤细胞的能力。

含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒载体的构建与鉴定

目的:构建含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒。方法:构建腺病毒穿梭质粒pDC312-DTREE,与骨架质粒共转染HEK293细胞,细胞内同源重组包装出腺病毒腺相关杂合病毒。PCR法鉴定病毒及TCID50法测定病毒滴度。杂合病毒感染NIH3T3细胞观察转基因的表达,ELISA法测定表达产物浓度。结果:穿梭质粒pDC312-DTREE经限制性核酸内切酶AatII及NotI酶切结果正确。PCR鉴定结果表明病毒DNA内有人β-内啡呔DNA序列,且无野生型病毒的污染,病毒滴度为1.29×1010PFUml。病毒感染细胞后第3d,细胞培养液内有高浓度的β-内啡呔。结论:成功构建了含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒,为进行下游相关研究奠定了基础。

携带p53基因增殖性腺病毒影响肝癌细胞对化疗药物的敏感性

目的:研究携带p53基因增殖性腺病毒CNHK600-p53载体能否增加肝癌细胞株对化疗药物的敏感性。方法:构建携带p53基因增殖性腺病毒CNHK600-p53载体,采用四甲基偶氮唑盐法(methylthiazolyl tetrazolium assay,MTT),观察并比较单用化疗药物[5-氟尿嘧啶(fluorouracil,5-Fu)、丝裂霉素(mitomycin,MMC)和表柔比星(epirubicin,EPI)]、单用CNHK600-p53和CNHK600-p53联合上述化疗药物对肝癌细胞株BEL-7404的杀伤效应。结果:肝癌细胞株BEL-7404在5-Fu浓度为100μg/ml时细胞抑制率为(47±3)%,MMC浓度为1μg/ml时细胞抑制率为(20±4)%,EPI浓度为2.5μg/ml时细胞抑制率为(73±2)%,联合CNHK600-p53(MOI=10)后上述浓度的化疗药物细胞抑制率分别增高为(59±4)%、(44±4)%和(86±2)%(率的U检验,P<0.01)。结论:携带p53基因的CNHK600-p53能提高肝癌细胞株BEL-7404对化疗药物的敏感性,CNHK600-p53联合化疗药物治疗可望开辟克服肝癌耐药的新途径。

一种新型增殖型腺病毒治疗肝癌的体外研究

目的 评价增殖腺病毒CNHK500对肝癌细胞的治疗效果。方法利用病毒增殖实验、细胞活力实验(MTT)、蛋白印迹分析来检测增殖病毒CNHK500在端粒酶阳性的肝癌细胞株HepGⅡ、Hep3B、SMMC7721及正常细胞中选择性增殖和溶解细胞的特性。结果CNHK500感染人肝癌细胞株HepGⅡ、Hep3B、SMMC7721细胞后大量增殖，在感染后96小时增殖倍数分别为52000、396984．9和632911．3倍，同野生型5型腺病毒(wtAd5)类似。然而在正常细胞中，CNHK500的增殖能力较wtAd5大大减弱，感染96小时后仅增殖3．1～100倍，而wtAd5却高达3160～17357倍。MTT实验观察到在肝癌细胞HepGⅡ和Hep3B中，感染后第7天达到半数杀伤的MOI值(IC50)分别为2和0．01，而在正常成纤维细胞BJ细胞中却高达1000。在常氧情况下，用蛋白印迹可在肿瘤细胞中检测到腺病毒ElA蛋白的表达，但在正常细胞却检测不到。ElB蛋白仅在缺氧条件下(0．1％O2)的肿瘤细胞中表达。结论 实验结果表明CNHK500能有效地选择性在肝癌细胞中增殖、复制、杀伤，而在正常细胞中增殖和溶解细胞能力却大大减弱。联合治疗基因，CNHK500可能为肝癌的治疗提供一种新的策略。

血管内皮生长因子基因重组腺病毒载体的构建

目的 :构建携带人血管内皮生长因子基因的重组腺病毒载体。方法 :将人源性的 VEGF1 6 5c DNA正向插入到穿梭质粒 p HCMVSP1A的 CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,通过脂质体与 p JM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人 VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 ,通过 PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒 ,扩增、纯化并测定滴度。结果 :人VEGF1 6 5c DNA成功地正向插入到 p HCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组 DNA为模板 ,同时扩增出 5 76 bp的VEGF1 6 5c DNA基因片段和 86 0 bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了所构建病毒的正确性 ,病毒滴度为 2 .5× 10 9pfu/ m l。结论 :成功构建了表达人 VEGF1 6 5基因重组腺病毒载体 ,使

骨形态发生蛋白-4基因重组腺病毒载体的构建

目的:通过Cre/LoxP位点特异性重组系统构建携带人骨形态发生蛋白-4基因的重组腺病毒载体(Ad.BMP4)。方法:根据GenBank获得BMP4的基因序列合成引物,经PCR扩增获得长度为1230bp的BMP4基因片断,经酶切、测序鉴定后,与腺病毒穿梭质粒pSuCMV连接,随后与5'缺陷型腺病毒右臂的质粒pBGHloxPΔE1E3通过脂质体Lipofectamine2000共转染至293细胞,获得重组腺病毒Ad.BMP4,并予以扩增、纯化、鉴定。结果:经酶切电泳和测序证明获得的BMP4基因片断序列、大小和方向正确,目的基因插入的位置、方向正确,经重组、扩增和纯化后获得病毒滴度为2.9×109pfu/ml的重组腺病毒Ad.BMP4,以PCR扩增和测序的方法证实了所构建病毒含有目的基因的片断,安全性检测证明所构建的腺病毒无野生性腺病毒的存在。结论:通过Cre/LoxP位点特异性重组系统构建了腺病毒Ad.BMP4。采用的腺病毒载体点特异性重组的方法极大地提高了包装成功率,且包装成功的病毒颗粒均为含有目的基因的重组病毒,从而保证了重组过程的快速和高效。

氧依赖性降解结构域-RANTES融合基因腺病毒表达载体的构建及体外趋化活性观察

目的:构建携带活化T细胞表达和分泌调节因子(regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted,RANTES/CCL5)基因及氧依赖性降解结构域(oxygen-dependent degradation domain,ODD)融合基因的重组腺病毒,并观察其体外趋化活性。方法:PCR法将人RANTES基因与ODD融合,构建携带该融合基因的重组腺病毒SG511-CCL5-ODD;增殖实验观察重组腺病毒增殖特性,ELISA法观察常氧和缺氧条件下RANTES蛋白的表达;趋化试验观察重组腺病毒感染肝癌细胞后的趋化活性。结果:成功构建携带人RANTES-ODD融合基因的重组腺病毒SG511-CCL5-ODD;增殖实验表明重组腺病毒具有肿瘤选择性复制的特性;缺氧条件下重组病毒转染肝癌细胞后RANTES蛋白表达量均比常氧条件下高(P<0.05),显示ODD可有效调节RANTES蛋白表达;趋化试验表明重组腺病毒感染肝癌细胞具有趋化NK92细胞的作用。结论:重组腺病毒SG511-CCL5-ODD体外能有效感染肝癌细胞株HepG2和Hep3B,并在ODD调控下表达RANTES蛋白,有效发挥体外趋化NK92细胞的活性。

增殖性腺病毒CNHK600-p53的构建及对胰腺癌细胞抑制的体外实验研究

目的探讨携带p53基因的新型增殖性腺病毒CNHK600-p53的导入能否增加胰腺癌细胞株PANC1对化疗药物的敏感性。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法,观察化疗药物5-FU、丝裂霉素（MMC）和表阿霉素（epirubicin,EPI）单独应用及与CNHK600-p53联合应用对胰腺癌细胞株PANC1的杀伤效应。结果PANC1在5-FU浓度为400μg/ml时细胞抑制率为（65±4.2）%,MMC浓度为1μg/ml时细胞抑制率为（41±1.9）%,EPI浓度为10μg/ml时细胞抑制率为（65±1.8）%。转入CNHK600-p53（MOI=0.625）后再使用上述浓度的化疗药物,PANC1的细胞抑制率分别为（89±5.3）%、（60±2.3）%和（75±1.5）%。当MOI值为0.3125、0.625、1.25时,CNHK600-p53组和Ad-p53组的细胞抑制率分别为（27±2.5）%、（30±3.7）%、（61±4.3）%和（4±2.7）%、（5±3.5）%、（16±4.5）%。结论单用CNHK600-p53效果优于Ad-p53,携带p53基因的CNHK600-p53能提高胰腺癌细胞株PANC1对化疗药物的敏感性。

增殖型腺病毒载体介导mIL-12基因对胃癌细胞的杀伤作用(英文)

目的 :观察增殖型腺病毒载体介导的 m IL - 1 2基因对胃癌细胞的杀伤作用。 方法 :利用携带 m IL - 1 2基因的增殖型腺病毒转染胃癌细胞株 SGC- 790 1 ,通过病毒增殖实验、细胞病理效应、酶链免疫反应等分别观察病毒复制能力、病毒对胃癌细胞的杀伤作用及 m IL - 1 2表达水平。结果 :携带 m IL - 1 2基因的增殖型腺病毒转染胃癌细胞株 SGC- 790 1具有肿瘤增殖型腺病毒 ONYX- 0 1 5的相似作用 ,可在肿瘤细胞内复制、增殖并杀死肿瘤细胞 ,而并不能在正常细胞内复制及增殖。该病毒在肿瘤细胞内的增殖能力是传统载体的近千倍。该载体携带的 m IL - 1 2基因的表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体体系 ,是传统基因治疗表达量的百倍。 结论 :CNHK2 0 0 - m IL - 1 2能在胃癌细胞中增殖并杀死胃癌细胞 ,并提高目的基因的表达水平 。

携带Herceptin与MICA胞外结构域融合基因的重组腺病毒的构建及鉴定

通过构建能表达抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为进一步联合NK细胞的治疗研究奠定基础。采用Overlap-PCR的方法获得Herceptin与MICA胞外结构域的融合基因,并将融合基因连接到载体pDC339上。接着再利用酶切及PCR方法鉴定载体及重组病毒基因的正确性,并通过ELISA和West-ern Blot检测融合蛋白的表达情况,最后经间接免疫荧光分析(IFA)检测融合蛋白的结合特性。构建的载体酶切后经电泳鉴定证实构建成功,重组病毒DNA的PCR显示病毒携带了Herceptin的轻链基因、重链基因及MICA胞外结构域的基因;ELISA和Western Blot证实重组腺病毒成功地表达出了目的融合蛋白;IFA实验表明融合蛋白能与SK-OV-3细胞表面的Her-2受体特异性地结合。最后成功地构建了能表达具有正常结合特性的抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为之后与NK细胞的联合治疗研究奠定基础。

利用杆状病毒系统获得携带抗体表达基因的双链AAV的研究

研究使用二杆状病毒-昆虫细胞系统获得携带抗体表达基因的8型双链腺相关病毒(scAAV)。首先利用杆状病毒系统获得ssrAAV8-EGFP和scrAAV8-EGFP,实验表明scrAAV8-EGFP比ssrAAV8-EGFP具有更高的转导效率;然后以同样的方法获得scrAAV8-AT7,检测其滴度,并感染HEK293细胞以检测抗体的表达情况。蛋白印迹法检测出阿瓦斯汀(Avastin)重轻链已成功表达,ELISA检测出Avastin在体外的表达量可达770ng/mL。该研究表明利用杆状病毒系统所获得8型scAAV具有生物学活性并能实现外源基因的体外表达。

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达。万法:将人源性的VEGF165 cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达。结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610 bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108pfu／ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达。结论:成功构建了表达人VEGF165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础。

人脐带间充质干细胞在3种不同培养体系中的生长状况及腺病毒感染效率

背景：目前所报道的脐带间充质干细胞体外培养条件及培养效率不尽相同,尚缺乏统一标准。而且由于不同来源的间充质干细胞生物学特征尚有一定差异,因此建立脐带间充质干细胞简便、高效的培养体系十分必要。目的：观察人脐带来源的间充质干细胞在体外不同培养体系中的生长状态,以及不同腺病毒感染的效率。方法：采用胶原酶消化法从正常足月新生儿脐带中分离出间充质干细胞,贴壁法纯化培养,细胞贴壁后利用低糖DMEM,MesenPRO RSTM Medium和STEMPRO MSC SFM这3种培养体系进行体外扩增。取对数生长期的第3~5脐带间充质干细胞,应用腺病毒Ad5-EGFP,Ad5/11-EGFP,Ad5/35-EGFP分别以感染复数=1,10,100进行感染,分别于感染后24,56,72h倒置荧光显微镜观察病毒感染及绿色荧光表达情况。结果与结论：使用低糖DMEM培养的细胞初期融合时间长,STEMPRO MSC SFM培养的细胞虽然连接紧密,但消化传代后不易贴壁,而MesenPRO RSTM Medium培养的细胞在相同时间内能达到较高的细胞密度,更适于脐带间充质干细胞的体外扩增。Ad5/35-EGFP感染脐带间充质干细胞的效率明显高于其他两种腺病毒,但可导致细胞凋亡;腺病毒Ad5/11-EGFP对脐带间充质干细胞的感染效率较佳,随着感染复数的升高,所表达的荧光强度也逐渐增大。

表达人内啡肽的腺病毒腺相关杂合病毒的构建及体外表达分析

应用分子生物学方法将人β_内啡肽融合基因序列克隆入腺病毒穿梭质粒pDC312_AAVEE,后者与骨架质粒共转染HEK293细胞,包装得到含转基因腺病毒腺相关杂合病毒AdAAV_EE。用PCR方法对杂合病毒进行鉴定,TCID50法测定病毒滴度。杂合病毒感染体外培养细胞观察转基因表达,ELISA法测定培养液中表达产物浓度。PCR法证实转基因正确插入了杂合病毒基因组内,且没有野生型病毒污染,病毒滴度为1.29×1010PFUmL。结果表明转基因从第1天到第14天的表达水平呈上升趋势,第14天达到3141pgmL。

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外靶向性转染心肌细胞

目的 :构建以鼠心肌轻链蛋白基因 (mlc- 2 v)为启动子、携带人血管内皮生长因子 h VEGF1 6 5基因的重组腺病毒载体 ,检测该重组腺病毒载体对心肌细胞转染的靶向性。 方法 :酶切腺病毒载体 PDC31 5自身启动子 CMV,构建腺病毒载体PDC31 7,分别接入 h VEGF1 6 5、mlc- 2 v基因 ,构建腺病毒载体 PDC- mlc- h VEGF1 6 5。鉴定正确后 ,将 PDC- mlc- h VEGF1 6 5与 L ipo-fectam ine共转染至 2 93细胞 ,经同源重组获得以 m lc- 2 v为启动子、携带 h VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 Ad- m lc- h VEGF1 6 5,同步构建无靶向性的重组腺病毒 Ad- h VEGF1 6 5。扩增并测定滴度后 ,Ad- h VEGF1 6 5、Ad- mlc- h VEGF1 6 5分别转染体外培养的心肌细胞、骨骼肌细胞及平滑肌细胞 ,利用 EL ISA、Western印迹分析等方法检测 Ad- mlc- h VEGF1 6 5转染心肌细胞的靶向性。 结果 :构建的病毒正确 ,病毒滴度为 2 .8× 1 0 9pfu/ ml。转染 3d后 ,Ad- h VEGF1 6 5组在各培养细胞的上清液及细胞内均检测到 VEGF的表达 ,而 Ad- mlc- h VEGF1 6 5组仅在心肌细胞中有 VEGF的表达 ,且 Ad- m lc- h VEGF1 6 5组心肌细胞分泌的 VEGF要少于 Ad-h VEGF1 6 5组。结论 :成功构建了以 mlc- 2 v为启动子、携带人 VEGF基因的重组腺病毒 Ad- m lc-

携带RGD多肽的嵌合型腺病毒载体AD11-RGD-4C-EGFP的构建及其感染效率的研究

目的在嵌合型腺病毒的fiber中插入具有整合素特异性的RGD肽,构建可提高腺病毒感染效率的腺病毒载体,观察其对人肝癌细胞株HepG2、BEL-7404以及成纤维细胞BJ的感染效率。方法将RGD-4C插入到AD5/11嵌合型腺病毒载体fiber的HI区,与腺病毒骨架质粒pPE3共转染大肠杆菌BJ5183,同源重组产生腺病毒重组质粒(pPE3-F11-RGD-4C),该重组质粒与PDC328-EF1-EGFP共转染人胚肾293细胞进行包装,产生重组腺病毒(AD11-RGD-4C-EG-FP)。用该重组腺病毒感染HepG2、BEL-7404以及BJ细胞,通过荧光显微镜观察感染效率。结果所构建的重组腺病毒PCR扩增出1 123 bp包含目的片段的基因片段。同时,制备了高滴度的重组病毒,纯化后病毒滴度为1.3×1010pfu/ml。当MOI=10,48 h时该重组病毒对HepG2、BEL-7404及BJ细胞的感染效率明显高于对照组腺病毒(AD11-EGFP)。结论成功构建了可提高腺病毒感染效率的嵌合型腺病毒(AD11-RGD-4C-EGFP),为进一步的研究奠定了基础。

降低亲和力提高HER2-CAR-T细胞治疗的安全性

目的探讨降低CAR-T细胞亲和力是否能有效提高其杀伤特异性,减少"脱靶效应"。方法构建靶向HER2的中等亲和力和高亲和力的La-G3HER2-CAR和Ha-G3HER2-CAR并电穿孔转染T细胞,采用Western Blot、FCM技术和xCELLigence RTCA DP进行CAR载体表达和杀伤功能检测。结果 La-G3HER2-CAR-T细胞和Ha-G3HER2-CAR-T细胞分别表达43 000和58 000的外源CAR载体片段,转染效率分别为58.1%和69.0%。高亲和力的Ha-G3HER2-CAR-T细胞对高、中、低水平表达HER2的6种靶细胞均有效杀伤,而低亲和力的La-G3HER2-CAR-T细胞高效杀伤HER2高表达的SK-OV-3和BT474细胞,对HER2中表达的MDA-MB-231和HCC-202的杀伤作用较弱,而对低水平表达HER2的MCF-7和293细胞不杀伤。进一步的机制研究发现,HER2中水平表达的MDA-MB-231细胞共培养对La-G3HER2-CAR-T细胞和Ha-G3HER2-CAR-T细胞激活和细胞因子分泌诱导水平不同(CD107a:8.2%vs 71.6%;IFN-γ:66.3%vs 83.4%;TNF-α:73.4%vs 94.1%)。结论中等亲和力La-G3HER2-CAR-T细胞比高亲和力的Ha-G3HER2-CAR-T细胞的杀伤作用特异性更强,降低CAR-T细胞的亲和力可以提高治疗的安全性。

应用杆状病毒系统制备8型腺相关病毒

目的建立应用杆状病毒系统制备8型腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的技术体系,并初步检测所制备病毒的感染活力。方法采用杆状病毒生产系统包装rAAV8-EGFP,经高效液相色谱法提取并纯化病毒,实时荧光定量PCR测定病毒滴度,通过观察绿色荧光蛋白的表达强度来检测rAAV8-EGFP对HEK-293细胞的感染活力。结果实时荧光定量PCR显示成功制备高滴度rAAV8-EGFP,滴度可达1.5×1012vg/ml,100ml摇瓶共得到1.5×1013vg rAAV8-EGFP病毒颗粒;感染后的HEK-293细胞具有较强的绿色荧光蛋白表达。结论应用杆状病毒系统成功制备高滴度、高活力的重组腺相关病毒,为后续研究奠定了基础。

正向和反向SV40 poly(A)信号序列对上游基因表达的影响

目的研究正向和反向SV40poly(A)信号在3种常用细胞株中对上游基因表达的调控作用,为基因表达研究中载体poly(A)信号的选择提供依据。方法将F-Luc与R-Luc两种荧光素酶基因插入同一质粒,构建带有双荧光素酶报告基因的载体Dual-Luc。在F-Luc基因后分别插入正向和反向互补的SV40poly(A)信号序列,得到2个带有不同SV40poly(A)信号的载体Dual-Luc2、Dual-Luc3。将其分别转染常用的3类细胞株293、L-02和HeLa细胞,应用双荧光素酶标仪和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定报告基因(F-Luc)的表达量,以R-Luc基因的表达量作对照。结果成功构建携带正向和反向互补SV40poly(A)序列的双荧光素酶载体Dual-Luc2、Dual-Luc3;双荧光素酶标仪检测表明,在293细胞中,Dual-Luc2、Dual-Luc3的F-Luc/R-Luc比值分别为3.25±0.43、3.03±0.14,差异无统计学意义(P>0.05);在L-02细胞中,Dual-Luc2、Dual-Luc3的F-Luc/R-Luc比值分别为6.16±0.39、3.83±0.39,差异有统计学意义(P<0.05);在HeLa细胞中,Dual-Luc2、Dual-Luc3的F-Luc/R-Luc比值分别为1.21±0.10、0.66±0.02,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测与荧光素酶检测结果一致。结论不同细胞中poly(A)信号序列对上游基因的调控作用存在差异;poly(A)信号对上游基因的调控作用主要发生于转录水平。