血管紧张素-(1-7)通过抑制TLR4激活和坏死性凋亡的相互作用对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤

目的:研究血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]能否通过抑制Toll样受体4(TLR4)激活和坏死性凋亡的相互作用对抗高糖(HG)引起的H9c2心肌细胞损伤。方法:应用Western blot检测心肌细胞受体相互作用蛋白3(RIP3;反映坏死性凋亡的指标)和TLR4的表达水平;CCK-8法测定心肌细胞存活率;用试剂盒检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性;ELISA检测细胞培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌水平;双氯荧光素染色法测定细胞内活性氧簇(ROS)水平;罗丹明123染色法测定线粒体膜电位(MMP)。结果:HG(35 mmol/L葡萄糖)作用H9c2心肌细胞24 h可使RIP3的表达水平明显升高,应用30μmol/L TAK-242(TLR4抑制剂)和HG共处理心肌细胞24 h可抑制HG对RIP3的上调;另一方面,HG可上调TLR4的表达,100μmol/L坏死性凋亡的特异性抑制剂necrostatin-1(Nec-1)和HG共处理心肌细胞24 h可抑制HG对TLR4的上调;而1μmol/L Ang-(1-7)和HG共处理心肌细胞24 h能同时抑制HG对RIP3和TLR4的上调。此外,1μmol/L Ang-(1-7)、30μmol/L TAK-242或100μmol/L Nec-1与HG共处理心肌细胞均能对抗HG引起的心肌细胞损伤,细胞存活率升高,LDH活性降低,ROS生成和MMP丢失减少,同时IL-1β和TNF-α的分泌减少。结论:Ang-(1-7)通过抑制TLR4激活和坏死性凋亡的相互作用对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤。

尼可地尔对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症反应

目的探讨尼可地尔(nicorandil,Nic)能否通过调控核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)/环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)通路对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症。方法应用细胞计数盒(CCK-8)检测心肌细胞存活率;蛋白质免疫印迹法测定NF-κB、COX-2和cleaved caspase-3蛋白的表达水平;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测细胞培养液中LDH的活性;双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法测定凋亡细胞数量;罗丹明123染色荧光显微镜照相法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP);ELISA法检测细胞培养液中白介素^(-1)β(IL^(-1)β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果 35 mmol·L^(-1)葡萄糖(高糖,HG)作用H9c2心肌细胞24 h能明显降低心肌细胞存活率。在HG作用前,应用20~100μmol·L^(-1)Nic预处理60 min或50μmol·L^(-1)Nic预处理30~120 min均可明显对抗HG对心肌细胞存活率的抑制作用。另一方面,HG可上调心肌细胞磷酸化(p)-NF-κB p65和COX-2的表达,50μmol·L^(-1)Nic预处理心肌细胞60 min能抑制HG诱导的p-NF-κB p65和COX-2表达的上调。此外,HG作用心肌细胞24 h可引起明显的心肌细胞损伤和炎症反应,使培养液中LDH活性、ROS生成、凋亡细胞数量、cleaved caspase-3表达、MMP丢失及炎症因子IL^(-1)β和TNF-α的分泌均增加;在HG作用前,应用50μmol·L^(-1)Nic预处理心肌细胞60 min或应用100μmol·L^(-1)PDTC(NF-κB抑制剂)或10μmol·L^(-1)NS-398(COX-2抑制剂)和HG共处理心肌细胞24 h能明显拮抗HG引起的上述损伤和炎症反应。结论 Nic通过抑制NF-κB/COX-2通路对抗HG引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症。

ATP敏感性钾通道在硫化氢抑制坏死性凋亡介导的高糖致H9c2心肌细胞炎症中的作用

目的:探讨ATP敏感性钾通道(K_ATP通道)在硫化氢(H2S)抑制坏死性凋亡介导的高糖(HG)致H9c2心肌细胞炎症中的作用。方法:应用Western blot法测定受体相互作用蛋白3(RIP3)和环氧化酶-2(COX-2)的表达水平;ELISA检测细胞培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果:H9c2心肌细胞经HG(35 mmol/L葡萄糖)处理24 h,其RIP3的表达水平明显升高,100μmol/L K_ATP通道开放剂二氮嗪(DZ)和400μmol/L H_2S的供体硫氢化钠(Na HS)预处理心肌细胞30 min均可抑制HG对RIP3表达的上调;100μmol/L K_ATP通道阻断剂5-羟基癸酸(5-HD)预处理心肌细胞30 min可阻断Na HS对HG上调RIP3表达的抑制作用。另一方面,100μmol/L坏死性凋亡的特异性抑制剂necrostatin-1共处理或100μmol/L DZ、400μmol/L Na HS预处理心肌细胞均能抑制高糖引起的心肌细胞炎症,使COX-2表达及IL-1β和TNF-α的分泌水平均减少;而100μmol/L 5-HD能明显拮抗Na HS的上述抗炎症反应作用。结论:K_ATP通道在H_2S抑制坏死性凋亡介导的高糖致心肌细胞炎症反应中发挥重要的作用。

硫化氢通过抑制ROS-TLR4通路对抗高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤和炎症反应

目的探讨外源性硫化氢(H2S)能否通过抑制活性氧(ROS)-Toll样受体4(TLR4)通路对抗高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤和炎症反应。方法应用细胞计数盒(CCK-8)检测细胞存活率,用试剂盒检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,ELISA检测细胞培养液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平,Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法测定凋亡细胞数量,Western blot测定TLR4和Cleaved Caspase 3蛋白的表达水平,双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定细胞内ROS水平,罗丹明123染色荧光显微镜照相法检测线粒体膜电位(MMP)。结果应用35 mmol/L葡萄糖(高糖)作用H9c2心肌细胞24 h能上调TLR4的表达水平。在高糖作用前,应用1000μmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理60 min或400μmol/L硫氢化钠(Na HS)预处理30 min能明显减轻高糖对TLR4蛋白表达的上调作用。高糖作用心肌细胞24 h可引起心肌细胞损伤和炎症反应,使细胞存活率降低,LDH活性、凋亡细胞数量、Cleaved Caspase 3蛋白的表达、ROS生成、MMP丢失及IL-1β和TNF-α的分泌增加;400μmol/L Na HS预处理心肌细胞30 min后再予高糖作用24 h或30μmol/L TAK-242(TLR4抑制剂)和高糖共处理心肌细胞24 h能显著拮抗高糖引起的上述损伤和炎症反应。结论外源性H2S可通过抑制ROS-TLR4通路对抗高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤和炎症反应。