酵母PMT1与PMT5双基因缺失对细胞复制性寿命的影响

为研究蛋白质O-甘露糖转移酶-1(Protein O-mannosyltransferase-1,Pmt1p)与Pmt5p基因对酵母细胞寿命的影响,采用一步基因置换法构建PMT5基因缺失菌株(pmt5Δ),在此基础上,缺失PMT1基因,构建PMT1和PMT5双基因缺失菌株(pmt1Δpmt5Δ)。显微镜下分离和计数酵母子细胞的数目,统计菌株的复制性寿命;检测细胞吸光度值来评价细胞分裂增殖速度。结果发现,与对照组酵母细胞的平均复制性寿命(25代)比较,pmt5Δ菌株(26代)的寿命无明显变化(P> 0. 05),而pmt1Δpmt5Δ菌株(21代)的寿命明显缩短(P <0. 01);热量限制条件下,与对照组酵母细胞比较,pmt5Δ菌株的生长曲线无明显变化,而pmt1Δpmt5Δ菌株的生长曲线低平,细胞分裂增殖减慢。结果表明,PMT1与PMT5双基因缺失明显缩短酵母细胞的寿命,机制可能与细胞的增殖活力下降有关。

酶连接介导PCR法构建酵母PMT3基因缺失菌株

目的本文运用酶连接介导的PCR法构建酿酒酵母PMT3基因缺失菌株。方法以酿酒酵母基因组DNA为模板,PCR扩增PMT3基因开放阅读框两侧片段,双酶切后,定向克隆于pRS305载体;限制性内切酶MluⅠ线性化基因缺失重组载体(pRS305-pmt3-ko),采用醋酸锂的方法将重组载体转化酵母细胞;经营养缺陷型培养基筛选,PCR法验证阳性克隆酵母菌株。结果基因缺失重组载体测序正确,PMT3基因缺失酵母菌株构建成功。结论利用基因缺失重组载体pRS305-pmt3-ko,成功构建PMT3基因缺失酵母菌株。

酿酒酵母PMT1与PMT2双基因过表达菌株构建及其复制寿命研究

目的构建酿酒酵母蛋白质O-甘露糖转移酶PMT1与PMT2双基因过表达菌株,研究其对酵母细胞复制性寿命的影响。方法以PCR技术为基础,通过分子克隆的方法构建PMT2基因表达载体;通过同源重组实现PMT1和PMT2双基因在酵母细胞中过表达;实时定量PCR验证过表达菌株中相关基因的转录水平;光学显微镜下分离和计数酵母目细胞产生子细胞的数目,检测酵母细胞的复制性寿命。结果通过克隆技术成功构建PMT2基因过表达载体(pRS305-PMT2-ox),并转化和筛选出PMT1与PMT2双基因过表达菌株(PMT1ox PMT2ox);转录水平分析证明PMT1和PMT2基因表达上调;复制性寿命检测结果显示:与野生型菌株比较,PMT1ox PMT2ox菌株的平均寿命无明显变化。结论过表达PMT1与PMT2基因不影响酵母菌株的平均复制性寿命,提示PMT1与PMT2双基因过表达不参与酵母复制性寿命的调节。

酿酒酵母PMT1与PMT3双基因缺失对细胞寿命的影响

研究蛋白质O-甘露糖转移酶(Protein O-mannosyltransferase,PMT)家族中PMT3基因缺失,以及PMT1与PMT3双基因缺失对酵母细胞复制性寿命的影响。采用一步基因置换法构建PMT3基因缺失酵母菌株(pmt3Δ),基于基因同源重组的原理,构建PMT1和PMT3双基因缺失酵母菌株(pmt1Δpmt3Δ);显微镜下分离和计数酵母子细胞的数目,统计酵母细胞复制性寿命。与野生型酵母细胞的平均复制性寿命(26代)比较,pmt3Δ菌株(24代,P>0.05)和pmt1Δpmt3Δ菌株(25代,P>0.05)的平均寿命均无明显变化,差异无统计学意义。酵母PMT3单基因缺失,以及PMT1和PMT3双基因缺失均不影响细胞的复制性寿命。

酵母ATG8与PMT1双基因缺失菌株的构建及鉴定

目的构建自噬相关ATG8与蛋白质O-甘露糖转移酶1(PMT1)双基因缺失酵母菌株。方法一步基因置换法构建ATG8基因缺失菌株(BY4741 atag8::LEU2);通过将不同配型的酵母细胞杂交、显微镜下四分体拆分,平板印记、缺陷型培养基筛选等方法,构建ATG8和PMT1双基因缺失菌株(BY4742 agt8::LEU2 PMT1::URA3);PCR鉴定阳性克隆基因组DNA。结果 ATG8基因缺失菌株电泳条带为2759 bp和980 bp,ATG8和PMT1双基因缺失菌株电泳条带分别为2759 bp,980bp,1630 bp和731 bp。四分体拆分实验发现ATG8基因缺失酵母细胞形成较小的单克隆。结论成功构建ATG8基因缺失菌株和ATG8与PMT1双基因缺失菌株;缺失ATG8基因酵母细胞形成较小的单克隆。

AHSA1基因缺失酿酒酵母株的构建及其对生长的影响

目的构建酿酒酵母AHSA1基因缺失菌株,并观察其对生长的影响。方法运用基因同源重组技术构建单基因缺失的酿酒酵母株,采用生长曲线测定法和克隆形成实验检测AHSA1缺失对生长的影响。结果成功构建AHSA1基因缺失酵母菌株。与野生型酵母相比,AHSA1缺失菌株的克隆形成能力及短期增殖活性明显降低。结论AHSA1基因缺失可抑制酿酒酵母生长。

酿酒酵母PMT6基因缺失对细胞寿命的影响

[目的]构建蛋白质O-甘露糖转移酶(Protein O-mannosyltransferase)-6基因缺失酵母菌株,研究其对细胞寿命的影响。[方法]以pRS306质粒为模板,采用一步基因置换方法构建PMT6基因缺失菌株(pmt6Δ);光学显微镜下分离和计数酵母母细胞产生子细胞的数目,检测酵母细胞的复制性寿命;在热量限制条件下(含0.5%葡萄糖培养基),检测酵母细胞分裂增殖速度。[结果]成功构建pmt6Δ菌株;与对照组酵母细胞的复制性寿命(25.2代)比较,pmt6Δ菌株的寿命(25.4代)无明显变化(P>0.05);在热量限制条件下,pmt6Δ菌株的生长曲线低平,细胞分裂增殖减慢。[结论]PMT6基因不参与酵母细胞复制性寿命的调控,而热量限制影响PMT6基因缺失细胞的分裂增殖能力。