碳青霉烯酶OXA-72在毕赤酵母中的表达和纯化

目的对我国临床分离的第一株鲍曼不动杆菌产生的碳青霉烯酶OXA-72在毕赤酵母表达系统中进行重组表达及分离纯化。方法提取临床分离的鲍曼不动杆菌菌株40的基因组DNA,PCR扩增oxa-72全基因;将oxa-72基因双酶切回收后与毕赤酵母表达载体连接,重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定;电转化法将线性化的重组表达DNA转导入GS115感受态细胞,在Zeocin平板上筛选阳性转化子,并通过PCR和Western进行验证;对阳性克隆进行头孢硝噻吩实验,检测表达OXA-72的活性。用镍柱分离纯化OXA-72。结果以该株鲍曼不动杆菌的基因组DNA为模板,用目的引物进行PCR可获得843 bp的特异扩增条带;DNA测序证明核苷酸序列与Genbank公布的oxa-72基因序列100%一致;电转化后经Zeocin平板筛选得到一株阳性克隆,SDS-PAGE表明重组蛋白的相对分子量在34~43 kDa之间,Westem blot分析显示,重组蛋白能特异地与抗His-Tag抗体结合。头孢硝噻吩试验为阳性。纯化得到纯度为95%的重组蛋白,纯化回收率达40%。结论成功构建了OXA-72的表达载体,在毕赤酵母中成功地表达并分离纯化了具有...

医院获得性肺炎患者分离耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌OprD的表达

目的研究耐碳青霉烯类抗菌药物铜绿假单胞菌(PAE)OprD的表达水平,探讨济南地区PAE耐碳青霉烯类抗菌药物的机制。方法收集从医院获得性肺炎患者痰液中分离的PAE,提取13株耐碳青霉烯类抗菌药物菌株的RNA,应用荧光实时定量PCR分析PAE外膜蛋白oprD的基因表达水平;采用超声破碎法制备外膜蛋白,超速离心收集外膜蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离外膜蛋白,观察OprD的表达。结果荧光实时定量RT-PCR检测PAEoprD基因表达的结果表明,实验室标准株Ct值oprD/rpsL为1.42;13株碳青霉烯类耐药株Ct值oprD/rpsL平均值为1.17,与实验室标准株相比,差异有统计学意义(t=3.0716,P<0.01),2株碳青霉烯类敏感株Ct值的oprD/rpsL平均值为1.58,与实验室标准株相比,差异无统计学意义;外膜蛋白电泳图谱表明,碳青霉烯类耐药株在45kDa处表达明显下降,此处外膜蛋白为OprD。结论济南地区PAE耐碳青霉烯类抗菌药物与OprD表达水平下降有关。

三种营养评估方法对老年慢性阻塞性肺疾病急性加重合并呼吸衰竭患者预后评估的比较研究

老年慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)急性加重合并呼吸衰竭的患者由于能量消耗增加,营养不良发生的风险也随之增加,继而导致患者治疗效果差和预后不良[1,2]。体重指数(BMI)、营养风险筛查2002评分(NRS2002评分)和血清白蛋白水平(ALB)是广泛应用于临床的营养评估方法。但目前我们对这些评估方法在老年慢阻肺急性加重合并呼吸衰竭患者预后影响的研究有限,尚未发现能够筛查存在营养风险患者的可靠指标。本研究中我们分析了影响老年慢阻肺急性加重合并呼吸衰竭患者预后的营养指标,同时比较其在预后评估中的临床价值。