逆转录环介导等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒基因

目的建立检测H7N9禽流感病毒基因的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription Loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法,并初步评估应用。方法设计、合成H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因、神经氨酸酶(NA)基因的引物组,通过优化参数,建立RT-LAMP反应体系,使用梯度稀释的标准品测试该体系检测灵敏度,并使用对比毒株测试特异性,再对142份临床标本进行实样检测。结果成功建立了检测H7N9禽流感病毒HA基因、NA基因的RT-LAMP方法,可直接肉眼观察判读结果,检测其HA基因、NA基因的敏感性分别达到10拷贝每反应、5拷贝每反应,对其他常见呼吸道病原无交叉反应;在测序证实阳性的临床样本中,对于病毒HA基因、NA基因检出率分别为100%、92.68%。结论逆转录环介导等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒基因,具有简单、快速、灵敏度高,检测结果可视化,无需特殊设备等优点,在禽流感病原监测上有一定应用前景。

基于纳米孔测序技术的呼吸道病原体快速确认

目的验证纳米孔测序技术在呼吸道病原体应急检测中的可行性。方法对某上呼吸道感染患者的咽拭子标本进行总核酸抽提并定量,接着进行cDNA的逆转录合成和测序文库构建,在便携式三代测序仪MinION上进行测序,然后对测序数据进行病原分类学分析,最后使用实时荧光定量PCR验证测序结果。结果MinION在15 h内共计产生188063条有效序列。测序数据分析表明,在咽拭子样本中同时检测到人呼吸道腺病毒7型和甲型流感病毒H3N2亚型,分别有19和4条序列匹配到参考基因组。测序开始9 h内,MinION已分别产出78.95%的7型腺病毒序列和100%的H3N2序列。从取样到初步获得鉴定结果,流转时间为18.6 h。实时荧光定量PCR与测序结果一致。结论MinION用于呼吸道病原体的快速检测具有可行性,且具备同时检测多种病原体并对病原分型的能力,在暴发疫情和呼吸道病毒应急检测方面具有应用价值。