bFGF对异种脱钙骨愈合过程中成骨细胞VEGF表达的影响

目的:了解不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)与异种脱钙骨复合修复骨缺损时,成骨量和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达水平之间的相关性。方法:在33只成年新西兰兔双侧下颌骨下缘形成15mm×5mm矩形骨缺损,每一缺损作为一个实验单位,术后4w取材作组织学检查,并分析成骨量和VEGF蛋白表达水平及其相互关系。结果:bFGF对于VEGF的表达与其诱导成骨作用一样存在双相剂量效应,VEGF表达和新骨形成呈密切关系。结论:bFGF可能是通过上调VEGF的表达,以促进血管化来实现增强异种脱钙骨愈合的。

人nm23-H1基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建表达人nm23-H1基因的重组腺病毒载体,并在人胚肾293细胞中进行鉴定。方法:以重组质粒pcDNA3.1-nm23-H 1中提取的nm23-H 1基因为模板,采用PCR法扩增基因片段。将扩增的基因片段插入穿梭质粒pSh uttle-CMV,并转化大肠肝菌DH 5α。筛选重组质粒pSh uttle-CMV-nm23-H 1,电转化已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞。筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H 1,用Lipofectamine转染293细胞,制备携带人全长nm23-H 1基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-nm23-H 1。大量扩增Ad-nm23-H 1病毒颗粒,并测定病毒滴度。采用RT-PCR法检测nm23-H1基因在293细胞中的转录。结果:经PCR、酶切鉴定及DNA测序结果证实pSh uttleCMV-nm23-H 1及pAdEasy-nm23-H 1质粒正确构建,纯化后的Ad-nm23-H 1病毒颗粒感染性滴度为109.5(3.4×109)CCID50/ml,经RT-PCR扩增出的基因片段,与目的片段大小一致。结论:已成功构建了表达nm23-H1重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了依据。

nm23-H1基因转染前后人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中蛋白激酶C转位的变化

目的研究nm23-H1基因转染诱导人舌鳞状细胞癌(以下简称舌鳞癌)Tca8113细胞凋亡过程中蛋白激酶C-θ(PKC-θ)的作用。方法采用脂质体转染法将真核表达载体pAdEasy-nm23-H1转染人舌鳞癌Tca8113细胞株。应用PKC-θ活化抑制剂Calphostin C和DMSO预处理细胞30min后,常规培养24h,倒置显微镜观察细胞形态的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Westernblot分析Tca8113细胞中PKC-θ裂解活化状况;酶标仪(ELISA)检测Caspase-3的相对活性。结果人舌鳞癌Tca8113细胞胞浆中及核周存在PKC-θ的表达,nm23-H1基因转染后PKC-θ从胞浆、核周转位到细胞核内表达。nm23-H1基因转染可导致PKC-θ的裂解活化,形成功能性的催化片段,而CalphostinC抑制转染诱导的PKC-θ裂解活化。nm23-H1基因转染后,Calphostin C预处理组和DMSO预处理组Tca8113的凋亡率、Caspase-3的活性增加,两组间有明显差异(P<0.05)。结论 nm23-H1诱导细胞凋亡过程中有PKC-θ的裂解活化,PKC-θ是nm23-H1诱导舌鳞癌Tca8113细胞株凋亡过程中的参与者,PKC-θ激活Caspase-3诱导细胞凋亡是nm23-H1基因诱导肿瘤细胞凋亡机制之一。