糖络宁对DPN中IRE1-TRAF2-XBP-1途径的影响

目的探讨糖络宁对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠内质网应激IRE1-TRAF2-XBP-1途径的影响。方法以高脂饲料联合链脲佐菌素诱导SD大鼠致DPN模型,经糖络宁干预12周后,采用苏木精-伊红(HE)染色法观察大鼠坐骨神经形态的变化,采用免疫荧光法检测DPN大鼠坐骨神经EDEM、PDI和TRAF2蛋白表达,采用Western blot法检测DPN大鼠坐骨神经细胞凋亡途径P-JNK和caspase-3的蛋白表达。选用RSC96细胞株,采用高糖环境培养的施万细胞模型,用糖络宁含药血清分别干预24h和48h,采用高内涵分析方法分别测定糖络宁含药血清对施万细胞中EDEM、PDI、TRAF2和P-JNK蛋白表达的影响。结果 HE染色结果显示,模型组大鼠坐骨神经髓神经脱髓鞘严重;糖络宁低、高剂量组坐骨神经脱髓鞘现象得到改善,坐骨神经髓鞘积分吸光度显示,模型组比空白组明显降低(P <0. 05),糖络宁高剂量组得到明显改善(P <0. 05);免疫荧光结果显示,糖络宁高低剂量组能使EDEM和PDI表达增加(P <0. 01,P <0. 05),TRAF2表达降低(P <0. 01,P <0. 05); Western blot法检测结果显示,糖络宁高低剂量均显示P-JNK和caspase-3的表达降低。细胞实验中,24h和48h干预后的150mmol/L葡萄糖组EDEM与PDI显著性降低(P <0. 01),TRAF2与P-JNK显著性升高(P <0. 01);高糖高剂量组的EDEM在24h干预后的表达显著升高(P <0. 01),而P-JNK表达显著降低(P <0. 05); PDI在48h干预后的表达显著升高(P <0. 01);高糖高、低剂量组的TRAF2在24h和48h干预后均显著降低(P <0. 01)。结论糖络宁能够改善受损的坐骨神经结构,与糖络宁影响内质网应激相关IRE1-TRAF2-JNK途径相关,通过促进EDEM和PDI的表达,抑制TRAF2、P-JNK和caspase-3的表达,从而抑制神经细胞凋亡,改善DPN。

模拟干旱胁迫处理下北柴胡种苗MYC2基因的调控研究

该研究以北柴胡一年生种苗为材料,使用质量分数为10%、20%的PEG6000营养液进行模拟干旱胁迫实验,检测北柴胡根内源信号物质OPR、JA含量,转录因子BcMYC2和柴胡皂苷生物合成途径中4个关键酶基因HMGR、IPPI、FPS、β-AS表达量,以及柴胡皂苷a、d含量,探究模拟干旱胁迫下茉莉酸信号通路调控BcMYC2进而影响柴胡皂苷生物合成的机制。结果表明:(1)PEG6000模拟干旱胁迫处理北柴胡种苗后,20%PEG6000处理组根内OPR含量在2 h时出现峰值,10%PEG6000处理组的根内OPR含量在6 h时出现峰值;两个胁迫组内源JA含量均在2 h时出现峰值。(2)两个胁迫处理组北柴胡根内BcMYC2相对表达量均在2 h处出现峰值,之后的2~4 h时间段内大幅度下降,且20%PEG6000处理组的BcMYC2相对表达量高于10%PEG6000处理组;其余4个柴胡皂苷生物合成途径关键酶基因HMGR、IPPI、FPS、β-AS的相对表达量均在4 h时出现峰值,晚于BcMYC2相对表达量出现峰值的时间。(3)经模拟干旱胁迫处理后,北柴胡根内的柴胡皂苷含量在36 d内逐渐上升;在处理36 d时,20%PEG6000处理组的柴胡皂苷含量略高于10%PEG6000处理组,且两处理组均显著高于对照组。研究发现,经PEG6000模拟干旱处理后,北柴胡根内信号物质OPR及JA含量提高,促进BcMYC2的表达,进而提高柴胡皂苷生物合成途径中的关键酶基因的表达,最终显著提高了根内柴胡皂苷的含量。

高彦彬教授从络病论治慢性肾衰经验

慢性肾衰是各类进展性肾脏疾病的最终结局,病机错综复杂,中医对其治疗具有较好疗效。高彦彬教授学术思想师承国医大师吕仁和教授,临证四十载,认为此病属于“络病”范畴,并针对慢性肾衰提出肾元虚衰、肾络瘀结、浊毒内停的基本病机和益气固肾、解毒通络的基本治法。临床上以虚定型,以实定候进行辨证论治,并基于治未病理论,提出慢性肾病三级预防策略。

不同地理种源北柴胡种子性状及植株生长分析

我国北柴胡分布广,各地均有种植,但由于引种来源、种植技术和管理模式的差异,导致市售北柴胡药材性状不一、质量不稳、药效不可控。鉴定分析了我国7省份10产地栽培的北柴胡种子的地理变异、种子特性及植株生长状况,探讨了不同种源北柴胡种子和植株变异与生态环境相关性。结果表明,不同种源的北柴胡种子长度、宽度、厚度、千粒重及含水量等指标均存在显著性差异(P<0.05),种子千粒重与经度呈明显正相关,含水量与年降雨量呈明显正相关,其他地理生态因子与种子性状相关性不显著;不同种源北柴胡植株地上部和地下部生长存在显著差异(P<0.05),植株的茎粗与纬度呈明显的正相关,根茎干重与年均日照呈明显的正相关;欧式距离聚类分析显示10个产地北柴胡种子和植株聚为4类,不同类别植株和种子存在差异。

清毒汤对重症肝损伤大鼠肠道黏膜通透性的影响

目的观察清毒汤对重症肝损伤大鼠肠道黏膜通透性的影响,探讨该方治疗慢性重型肝炎(chronic severe hepatitis,CSH)的作用机制。方法建立硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)致重症肝损伤大鼠模型,以清毒汤进行干预治疗,采用血液生化法、ELISA法、Western Blot法,观察其对该模型大鼠肝功能的总胆红素(total bilirubin,TBIL)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)和反映肠道黏膜通透性的二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、闭锁连接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)及肠组织白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6的影响。结果 (1)与模型组相比较,乳果糖组及清毒汤小、中剂量组大鼠中TBIL、AST、DAO含量显著性下降(P<0.01);ZO-1蛋白的表达水平在所有治疗组中均有显著性升高(P<0.01);乳果糖组、清毒汤中剂量组IL-1β、IL-6的含量均显著性降低(P<0.01);(2)与乳果糖比较,清毒汤中剂量组TBIL、AST、DAO、IL-1β含量明显下降(P<0.05)及ZO-1表达水平显著性升高(P<0.01);清毒汤小剂量组中IL-6呈明显下降(P<0.05);清毒汤大剂量组中AST、DAO有显著性统计学差异(P<0.01)。结论清毒汤能降低重症肝损伤大鼠肠道黏膜的通透性,从而改善肝功能,其作用机制可能是减少有害物质穿过肠道黏膜屏障,进而减少其通过肝肠循环途径而加重肝损伤的发生机率。

清毒汤对重症肝损伤大鼠肠上皮细胞自噬的影响

目的观察清毒汤对实验性重症肝损伤大鼠血清中内毒素及白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)及白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23)和肠组织中自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的影响。方法将SPF级Wistar雄性大鼠采用数字表法随机分为正常组、模型组、乳果糖组、中药组,除正常组外,其余各组每日灌胃给予12 mg/kg硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA),持续12周,建立TAA致实验性重症肝损伤大鼠模型。第8周末,乳果糖组、中药组每日予以乳果糖1.6 g/kg、清毒汤5.95 g/kg灌胃治疗,连续4周后取材。HE染色观察肝与结肠组织病理变化,透射电镜观察肠上皮细胞中自噬体,酶联免疫吸附法检测大鼠血清中内毒素、IL-17、IL-23的含量,Western blotting法检测肠组织自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达。结果与正常组比较,模型组大鼠肝肠组织大量炎性浸润,自噬体较少,内毒素、IL-17、IL-23浓度显著升高,LC3蛋白及Beclin-1含量均显著下降(P<0.01);经清毒汤干预治疗后,炎性浸润明显减少,自噬体明显增多,内毒素、IL-17、IL-23浓度明显下降,且LC3Ⅱ/LC3I、Beclin-1蛋白含量均显著升高(P<0.01)。结论中药清毒汤可减轻TAA致肝损伤模型大鼠的肝、肠组织损伤,降低内毒素、IL-17及IL-23浓度,并提高自噬体数量及LC3、Beclin-1蛋白含量,说明清毒汤可能通过激活重症肝损伤大鼠的肠上皮细胞自噬,减少炎性因子的释放来降低内毒素的产生,从而减轻肝脏损伤。

糖络宁对高糖环境下雪旺细胞线粒体相关内质网膜的作用机制研究

目的:观察糖络宁含药血清对高糖环境下雪旺细胞(SCs)线粒体相关内质网膜(MAMs)的影响。方法:采用高糖环境培养48h的SCs(RSC96细胞株)模型,设立空白对照组、模型对照组、α硫辛酸(ALA)组、1%糖络宁组、10%糖络宁组。在电镜观察MAMs形态的基础上,采用免疫荧光标记法定量检测SCs中MAMs。梯度超速离心法分离MAMs,通过ELISA法检测MAMs上PKR样内质网激酶(PERK)的表达、Western Blot检测MAMs上线粒体融合蛋白2(Mfn2)的表达。结果:与空白对照组比较,模型对照组MAMs数量降低、PERK表达显著升高、Mfn2表达显著降低(P<0.01);与模型对照组比较,1%、10%糖络宁组MAMs数量均显著增加,PERK表达降低而Mfn2表达显著升高(P<0.01)。结论:糖络宁能够增加高糖环境下SCs中MAMs,与其增加Mfn2,降低PERK的表达有关。

基于网络药理学研究补阳还五汤干预缺血性脑卒中神经血管单元的作用机制

目的利用网络药理学方法研究补阳还五汤治疗缺血性脑卒中涉及的重要信号通路和保护神经血管单元的作用机制。方法使用TCMSP、上海有机所中药与化学成分数据库和相关文献获取并筛选补阳还五汤的活性成分及作用靶点;使用DrugBank数据库、药物靶标数据库(TTD)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)和GeneCards数据库获取缺血性脑卒中靶点。使用Cytoscape 3.7.2软件建立活性成分-治疗靶点网络,分析网络获取关键靶点。使用Metascape数据库对治疗靶点进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析。使用AlzData数据库分析治疗靶点的基因表达情况。结果通过网络分析,获得了补阳还五汤治疗缺血性脑卒中的关键靶点,包括前列腺素内过氧化物合酶2、前列腺素内过氧化物合酶1、毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1、β2肾上腺素能受体等;通过富集分析获取了补阳还五汤治疗缺血性脑卒中的多条关键信号通路,包括PI3K-Akt信号通路、钙信号通路、IL-17信号通路、血小板活化、Apelin信号通路、NF-κB信号通路、AMPK信号通路和花生四烯酸代谢通路等;通过基因表达分析了补阳还五汤对不同组织细胞的作用,发现治疗靶点在内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞和神经元中调控多种生物过程、细胞组成和分子功能。结论补阳还五汤治疗缺血性脑卒中具有多成分、多靶点、多通路、联系复杂的特点,在基因的细胞表达层面与神经血管单元密切相关,治疗作用机制包括神经保护、神经发生、抗血栓、促血管再生、胶质细胞调控等。

芍药苷干预施万细胞外泌体对背根神经元细胞凋亡的作用

目的探讨芍药苷(paeoniflorin,PF)干预高糖环境施万细胞(Schwann cell,SCs)外泌体(exosomes,EXOs)对背根神经节神经元(dorsal root ganglion neurons,DRGn)细胞凋亡的影响。方法取高糖环境SCs,培养24h,透射电镜观察EXOs的形态,蛋白印迹法(Western blot)鉴定EXOs特异性标志蛋白和氧化应激的蛋白表达;将SCs来源的EXOs与DRGn共培养24h,激光共聚焦显微镜观察DRGn摄取SCs来源EXOs的情况,Western blot法检测DRGn中影响细胞凋亡蛋白的表达水平。结果EXOs形态为双层膜囊泡结构,直径在40~100nm;EXOs中标记蛋白CD63表达证实了EXOs特异性;EXOs中氧化应激蛋白表达升高,尤其是PF干预SCs来源EXOs中Nrf2、HO-1的表达升高更明显;SCs来源EXOs被DRGn摄取,分布于DRGn细胞核周围;经PF干预SCs来源EXOs影响DRGn促凋亡蛋白GADD153和Bax表达显著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显增加。结论PF通过SCs EXOs携带氧化应激信息,影响DRGn中促凋亡蛋白表达减少,抗凋亡蛋白表达增加,从而减轻DRGn细胞凋亡,有利于改善糖尿病周围神经病变。

柴胡生物培养技术与柴胡皂苷合成生物学的研究进展

合成生物学是解析中药活性成分生物合成途径、发掘参与生物合成功能基因的一门新兴学科。柴胡是我国常用大宗中药材,药用价值显著。柴胡皂苷是其指标性成分,具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等显著活性。但目前野生柴胡资源遭到破坏,人工栽培过程中存在一定问题。生物培养技术及合成生物学的应用可扩大柴胡皂苷的来源,保护柴胡资源。不同植物的培养条件没有固定模式可遵循,不同药用活性成分的生物合成途径也是不一致的。目前,尚无柴胡组织培养技术及柴胡皂苷生物合成途径研究的综述报道。该文拟介绍合成生物学过程中用到的愈伤组织培养、不定根培养、毛状根培养与悬浮细胞培养等生物培养技术与柴胡皂苷生物合成途径及其关键酶功能基因的研究进展,建议通过借鉴其他传统根类药材的组织培养技术,对柴胡的生物培养技术进行优化,为深入研究柴胡皂苷的生物合成途径与代谢调控提供参考。

“一味丹参,功同四物”之内涵浅析

目的浅析“一味丹参,功同四物”的内涵,为临床的应用提供参考。方法通过查阅文献,概述古代本草典籍中对丹参及四物汤的记载,分析“一味丹参,功同四物”的具体内涵,以及现代研究中丹参的化学成分、丹参及四物汤的药理作用。结果与结论“一味丹参,功同四物”自古以来被医家广泛参考。结合丹参和四物汤的化学成分及药理作用,可以明确两者在临床应用方面的相似与不同。

应用ITS2条形码及种子形态鉴定柴胡属种子

目的:采用传统形态鉴定方法结合DNA条形码分子检测技术准确鉴定柴胡属种子。方法:收集41份市售柴胡属种子和GenBank数据库中下载15个品种75条核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列。利用体视显微镜和游标卡尺进行种子外观形态特征的观察和记录,测定千粒重。提取种子的基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增,双向测序得ITS2序列。基于BLAST法,邻接(NJ)系统进化树法,Kimura双参数模型(K2P)遗传距离法和ITS2序列二级结构进行物种鉴定。结果:不同基原的柴胡属种子在长、宽、横切面及千粒重等方面存在细微的差别;柴胡种子的ITS2序列有2个种内变异位点,3种单倍型,种内最大遗传距离0.009小于种间最小遗传距离0.032;NJ系统进化树中柴胡和狭叶柴胡分别聚为独立一支,具有良好的单系性;ITS2序列二级结构可以弥补NJ树在变种鉴定方面的不足。41份柴胡属种子样品中有30份柴胡,3份狭叶柴胡,5份三岛柴胡,2份藏柴胡及1份小叶黑柴胡。结论:市售柴胡种子存在来源多样、基原混乱的问题。基于ITS2条形码和种子形态鉴定相结合的方法可以准确鉴定柴胡属种子,为制定柴胡种子质量标准,规范柴胡种植,从源头解决柴胡药材质量问题提供科学依据,并为其他药用植物种子或者种子类药材的准确鉴定提供参考。

北柴胡MYC2转录因子的克隆及茉莉酸诱导的调控分析

髓细胞组织增生蛋白(MYC2)转录因子属于碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族,可以调控植物萜类次生代谢产物的合成。本研究首次从北柴胡毛状根中成功克隆一条MYC2转录因子全长基因序列,命名为BcMYC2,共2103 bp,开放阅读框长为2055 bp,编码684个氨基酸。生物信息学分析表明其与可可(Theobroma cacao)、蓖麻(Ricinus communis)等MYC2蛋白同源性较高;bHLH转录因子家族的系统进化树显示其与MYC2蛋白家族归为一类。组织特异性表达分析发现,BcMYC2基因在茎、叶中表达量较高,在根中表达量最低。使用不同浓度的茉莉酸甲酯诱导北柴胡毛状根,显示BcMYC2受茉莉酸信号调节,毛状根中柴胡皂苷合成途径的关键酶基因及柴胡皂苷含量有明显提高。本研究为进一步验证BcMYC2转录因子对柴胡皂苷生物合成途径的调控功能奠定基础。

雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析

该研究克隆得到1条雷公藤单萜合酶基因TwMS。其完整开放阅读框为1797bp,编码579个氨基酸,相对分子质量为69.75kDa、理论等电点为5.37。生物信息学分析表明,TwMS具有单萜合酶的特征结构域,属于萜类合酶TPSb亚家族。实时荧光定量PCR检测显示,经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,TwMS的相对表达量显著上调,并在24 h达到最高。此外,该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达TwMS蛋白,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

补阳还五汤干预脑缺血大鼠视束损伤的作用及关键药理途径的生物信息学分析

目的 观察补阳还五汤干预脑缺血大鼠视束损伤的作用,并探讨补阳还五汤干预脑缺血视束损伤的有效成分、核心靶点及调控机制。方法 采用线栓法制备右侧大脑中动脉栓塞致脑缺血的大鼠模型。将24只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤组(16.1 g/kg),每组各8只,连续灌胃30 d。采用横向弛豫时间定量成像(T2 mapping)检测视束损伤,弥散张量成像(DTI)结合弥散张量纤维束成像(DTT)分析视束微结构的改变。采用TCMSP、PubMed和中国知网数据库获取补阳还五汤有效成分及对应靶点,基于GeneCards、OMIM、DisGeNET、DrugBank数据库筛选缺血性视束神经损伤相关靶点,导入Cytoscape软件绘制活性成分-治疗靶点网络,运用STRING数据库构建蛋白互作网络(PPI),并进行蛋白簇聚类分析,基于Metascape数据库对核心蛋白簇进行KEGG通路分析。结果 T2 mapping显示,与假手术组相比,模型组大鼠视束区域rT2值升高(P<0.01);与模型组相比,补阳还五汤组大鼠视束区域rT2值降低(P<0.01)。DTI结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠及补阳还五汤组大鼠视束区域rFA值降低(P<0.01),rAD、rRD值增高(P<0.01);与模型组比较,补阳还五汤组大鼠视束区域rFA值升高(P<0.01),rAD、rRD值降低(P<0.01)。DTT结果显示,与假手术组比较,模型组与补阳还五汤组大鼠视束区域神经纤维的相对平均纤维束长度和密度均降低(P<0.05,P<0.01);与模型组相比较,补阳还五汤组大鼠视束区域神经纤维相对平均纤维束长度和密度均增加(P<0.05,P<0.01)。从补阳还五汤中筛选到与缺血性视束损伤相关的56个活性成分和400个潜在有效靶点,主要活性成分为黄芪甲苷Ⅳ、芍药苷和阿魏酸等,PPI核心基因为AKT1、TNF、TP53、CASP3、JUN等,PPI核心蛋白簇通过KEGG通路功能富集得到9条相关信号通路,在神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞中调控多种生物过程和分子功能,主要涉及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号通路、Toll样受体信号通路等,涉及细胞凋亡、能量代谢及炎性因子激活等重要生理生物过程。结论 补阳还五汤可减轻脑缺血大鼠视束神经损伤,促进视束超微结构损伤后的重塑,其干预缺血性视束损伤的作用可能是通过调控PI3K-Akt、丝裂原活化蛋白激酶、肿瘤坏死因子等多条信号通路影响神经元及胶质细胞功能来实现的。