湖南汉族1型糖尿病患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体及其配体基因多态性

目的探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）基因和KIR配体人类白细胞抗原-C（HLA—C）基因的多态性与1型糖尿病（T1DM）的关系。方法采用聚合酶链反应-序列特异性引物技术（PCR—SSP），对湖南汉族180例TIDM患者和199例正常对照者KIR基因、HIA—C基因进行检测和分析。结果（1）与正常对照相比，T1DM组KIR2DL1（98．9％比92．0％，OR=7．78，P=0．002）、3DL1（94．3％比86．4％，OR=2．67，P=0．009）和2DS4（83．9％比70．9％，OR=2．14，P=0．003）基因频率增高；（2）T1DM组和正常对照组HIJA—c（HIJA—C1、HLA—C2）基因频率差异无统计学意义，但T1DM组HLAC1＋／C2＋（3．9％比9．6％，OR=0．38，P=0．03）基因频率降低；（3）与正常对照组相比，T1DM组KIR／HLA－C基因组合中KIR2DL1-／HLA－C2－（0．6％比6．0％，OR=0．087，P=0．003）和KIR2DS1-／HLA—C2－（53．3％比64．8％，OR=0．62，P=0．023）基因频率降低。结论KIR基因多态性和KIR／HLA—C基因组合与T1DM发病相关。

锌转运体8自身抗体的放射配体检测法

目的建立锌转运体8自身抗体(ZnT8A)的放射配体检测法(RLA)。方法采用重组人ZnT8质粒,经试管内转录与翻译,获得^(35)S-ZnT8抗原,^(35)S-ZnT8与血清在自制旋转孵育器上旋转温育后,用蛋白A-琼脂糖沉淀免疫复合物。免疫复合物经TBST缓冲液洗涤后,用多功能闪烁发光分析仪检测沉淀物放射性计数值。参加国际糖尿病免疫学会(IDS)和美国疾病预防控制中心联合举办的第六次糖尿病自身抗体国际标准化评估(DASP 2009),评价该方法的敏感性和特异性。检测429例1型、855例2型糖尿病患者以及405例正常人ZnT8A水平,初步评价其临床应用价值。结果该方法批内CV3.9%～9.8%,批间CV4.3%～13.8%;DASP 2009显示,该方法敏感性66%,特异性100%。受试者操作特性曲线(ROC)分析显示,曲线下面积为0.879±0.034;该方法阳性阈值ZnT8A指数为0.011(405名正常人的99%百分位点),检测1型糖尿病患者阳性率24.0%,高于初诊2型糖尿病患者1.3%和健康人0.99%(P均<0.01)。结论建立的RLA法检测ZnT8A敏感性高、特异性强、重复性好,可应用于自身免疫糖尿病的诊断与分型。

胰岛素自身抗体微量平板放射免疫法的建立与应用

目的建立胰岛素自身抗体（IAA）的微量平板放射免疫（RIA）法，并探讨其临床应用价值。方法^125I-胰岛素与血清在微量平板4℃保温72h后，免疫复合物转移至已包被蛋白A的Millipore过滤平板中并洗涤，于多功能液体闪烁发光分析仪上测计数。以IAA指数≥0．06作为阳性标准，通过参加第四次国际糖尿病自身抗体检测标准化评估（DASP 2005），评价方法的灵敏度与特异性。并检测71例1型糖尿病（T1DM）患者、551例初诊2型糖尿病（T2DM）患者以及317名健康对照者IAA水平。采用SPSS 11．5软件进行t检验、非参数检验χ^2检验和直线相关分析；一致率用Kappa值评估。结果（1）优化的检测条件为5μl血清与2×10^4计数·min^-1的^125I-胰岛素于4℃缓慢振摇保温72h。（2）该方法批内CV4．8％～8．9％，批间CV6．4％～10．5％，DASP 2005反馈结果显示该法诊断T1DM灵敏度50％（25／50），特异性97％（97／100）。与国产IAA RIA试剂盒进行比较，结果判定总体一致率为72．9％（Kappa值0．402），相关系数（r）为0．678（P〈0．001）；26例结果不相符的标本中25例为该法检测阳性而国产RIA试剂盒检测阴性。（3）该方法检测T1DM患者的阳性率为19．7％（16／71），显著高于健康对照组的0．9％（3／317，χ^2=54．36，P〈0．001），其中0～9岁T1DM组9例中IAA阳性5例。检测初诊T2DM患者IAA阳性率1．5％，与健康对照组差异无统计学意义（χ^2=0．95，P〉0．05）。结论IAA微量平板RIA法灵敏度与特异性好，可应用于临床，IAA在婴幼儿T1DM患者中阳性率较高。

谷氨酸脱羧酶抗体微量平板放射结合检测法的建立与初步应用

目的建立谷氨酸脱羧酶抗体（GAD-Ab）的微量平板放射结合检测（RBA）法并评价其临床价值。方法采用^35S-GAD65抗原与血清在96孔平板中保温24h，而后转入已包被蛋白A的Millipore平板中，平板经洗涤后进行放射性计数，GAD—Ab结果以WHO标准单位（U／ml）表示。检测224名健康人、162例1型糖尿病（T1DM）和210例初诊2型糖尿病（T2DM）患者GAD—Ab浓度，评价其临床应用效果。并分别选择经典放射配体（RLA）法检测GAD—Ab指数呈梯度排列的T1DM患者和健康人共119名，比较RBA法和RLA法检测结果的一致率和相关性。对32名健康人、35例TIDM患者、24例T2DM患者同时采集静脉血和手指血，探索该方法检测手指血GAD—Ab浓度的可行性，同时也与RLA法比较。分别采用直线相关分析、t检验、方差分析、受试者工作特征（ROC）曲线等方法进行统计学处理。结果（1）优化的检测条件包括采用2μl血清与3×10^4计数·min^-1的标记抗原缓慢振荡保温24h，采用4℃PBS缓冲液洗涤沉淀物10次，采用Optiphase Supermix型闪烁液测量放射性计数。（2）该法检测GAD—Ab批内CV为3．8％～10．2％，批间CV5．6％～11．9％；GAD—Ab浓度在40．3～664U／ml范围内线性良好，检测限为3．6U／ml；该方法灵敏度78％，特异性98％，与经典RLA法结果判定一致率97．5％，Kappa值0．95，两者检测值呈显著正相关（r=0．915，P〈0．001）。（3）GAD—Ab在TIDM和T2DM患者阳性率分别为46．9％（76／162）和5．2％（11／210），明显高于健康人的n89％（χ^2值为123．5和10．1，P〈0．001和〈0．01）。（4）该方法检测手指血GAD—Ab与经典RLA法检测静脉血结果判定一致率96．7％，Kappa值0．905，检测结果呈显著正相关（r=0．946，P〈0．001）。结论建立的微量平板RBA法灵敏度、特异性、重复性好，能适用于末梢血GAD—Ab检测，具有较好的临床应用价值。