医学寄生虫学开放式课堂教学的探索与实践

随着信息技术的发展,开放式的课堂教学越来越受到学生的欢迎,对医学寄生虫学进行了开放式课堂教学的探索与实践,主要内容包括小班上课、微课教学、标本数字化、实验考试改革和讨论课教学,为我国创新医学人才培养模式的探索进行了有益的尝试。

新冠肺炎疫情形势下医学寄生虫学课程在线教学的探索与应用

2019年底,突发的新型冠状病毒引起的肺炎疫情迫使2020年春季高校开学日期推迟。根据教育主管部门“推迟开学不停学”的指导意见,笔者通过中国大学慕课平台开展了医学寄生虫学课程的在线教学工作。本文就教学准备、教学设计、教学过程、阶段考试、实验教学、案例教学以及成绩构成等方面进行了探索和应用,以期为同行教学提供参考。

10例疑似曼氏裂头蚴病的病原学诊断

目的对10例临床疑似曼氏裂头蚴病病例进行病原学诊断。方法 2009年8月至2011年8月,对4家医院送来的10例患者病理活检标本进行病原学鉴定。10个标本分别来源于腹部皮下包块4例,眼部肿块3例,脑部占位病变、肺部肿块和胸腔积液各1例。3例眼部肿块和1例腹部皮下包块中各取出1条虫体,通过肉眼和显微镜观察虫体解剖组织学特征进行鉴定。余6例标本均采用石蜡包埋、切片及苏木素-伊红(HE)染色后于镜下观察虫体组织,并以曼氏裂头蚴免疫兔血清为一抗通过免疫组化法作进一步鉴定。结果自3例眼部肿块中获取的3条完整虫体具典型曼氏裂头蚴形态特征,自腹部皮下包块取出的1条残断虫体在镜下观察到的网状结构和石灰小体均与曼氏裂头蚴解剖组织学特征一致。6个病理切片经HE染色后于镜下观察发现,3个切片呈现典型裂头蚴组织学特征,即体壁有凹凸不等的皱褶,皮层致密较厚呈嗜伊红深染,部分皮层外密布微毛,体内为网状疏松实质结构,可见空泡状石灰小体,但无器官腔和空腔结构;余3个病理切片的虫体组织结构不典型。6个病理切片经免疫组化检测均呈阳性。结论该10例临床疑似病例均确诊为曼氏裂头蚴病。

日本血吸虫未成熟卵单链抗体库的构建、筛选及初步应用

运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26～28ku特异性scFv大量表达.随后以此为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,以期获得SIEA26～28ku天然分子候选疫苗相关的编码基因.结果显示,所获得的SIEA26～28ku特异性scFv,表达量高,采用该探针初步筛选出相关基因核糖体蛋白S4.SIEA26～28ku特异性scFv的获得,为进一步筛选、分析鉴定抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗SIEA26～28ku的编码基因奠定了基础.

日本血吸虫pcDNA3/SjCWL01核酸疫苗的构建及其对小鼠免疫效果观察

目的构建日本血吸虫pcDNA3/SjCWL01核酸疫苗并进行免疫保护效果观察,评价其作为疫苗的潜能。方法将日本血吸虫基因SjCWL01亚克隆入真核表达载体pcDNA3,构建目的基因真核表达质粒,将pcDNA3/SjCWL01质粒转化大肠杆菌DH5α,大量制备DNA疫苗并免疫小鼠3次,间隔2w,末次免疫后2w,用ELISA法检测免疫鼠血清特异性抗体效价,日本血吸虫尾蚴进行腹部皮肤攻击感染,感染后45d剖杀冲虫,分别计算减虫率,每克肝、粪卵减少率。结果重组DNA疫苗(pcDNA3/SjCWL01)与对照组比较,虫荷、每克肝卵、每克粪卵数分别下降了27.6%,39.5%,45.9%。结论表明pcD-NA3/SjCWL01疫苗可诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。

日本血吸虫中国株琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白真核重组体的构建及其免疫小鼠的保护性研究

目的研究日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白(SjSDISP)全长编码基因DNA疫苗诱导小鼠的免疫保护性效果。方法将全长SjSDISP基因克隆到真核表达载体pcDNA3上,构建真核表达质粒pcDNA3-SjSDISP,用重组裸DNA免疫昆明小鼠3次,间隙2W,末次免疫后第二周进行日本血吸虫尾蚴攻击感染,感染后42 d处死小鼠,剖杀冲虫,计算减虫率和减卵率。结果经双酶切、PCR和测序验证,表明真核表达质粒pcDNA3-SjSDISP构建成功。动物免疫保护性实验结果显示:pcDNA3-SjSDISP疫苗组减虫率较低,与对照组相比减虫效果不明显(P>0.05);但在每克肝卵、每克粪卵和每雌子宫内卵方面,与对照组相比差异均具有显著性(P<0.01)。结论日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白DNA疫苗可能主要在抗血吸虫卵胚发育或抗生殖起作用,具有潜在的疫苗研究与开发价值。

腺病毒载体RNAi技术抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas表达

目的探讨RNAi技术对血吸虫病肝组织中Fas表达的作用。方法采用尾静脉注射腺病毒载体,在小鼠体内表达Fas-shRNA抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas的表达。冰冻切片荧光显微镜检查腺病毒载体对肝细胞的转染率,免疫组化和Western Blot方法检测肝组织Fas表达情况,RT-PCR方法检测肝组织Fas mRNA表达情况。结果免疫组化和Western Blot方法检测均表明RNAi组Fas表达受到抑制(t=29.799,P<0.01),模型组和HK对照组Fas表达增强。对Fas mRNA表达的RT-PCR方法检测也与上述结果一致。腺病毒载体对肝细胞的转染率达78.5%。结论腺病毒载体Fas-shRNA能够有效抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas的表达,尾静脉注射腺病毒载体能高效率感染肝细胞。

长沙市122例输入性恶性疟原虫pfpm2基因拷贝数变异的分析

目的了解长沙市近4年来输入性恶性疟原虫(Plasmodium falciparum,P.f)的血浆蛋白酶基因2(plasmodium falciparum plasmepsin 2,pfpm2)基因拷贝数变异(copy number variations,CNVs)情况,用以预测输入性抗药性虫株出现风险。方法收集长沙市输入性疟疾定点医疗机构在2016-2019年收治的单一感染P.f患者外周静脉血制作的干血斑样本122份,采用荧光实时定量PCR检测P.f的pfpm2基因CNVs,以P.f的pfpm2基因CNVs增加参数来分析抗药虫株在不同输入年份间和不同输出国间产生的可能性。结果来自25个输入国122例P.f患者的临床虫株pfpm2基因CNVs值为1.222±0.422,显著高于标准虫株3D7 CNVs值(1.007±0.023,P<0.001)。在122个临床虫株中,有23个pfpm2基因的CNVs值>1.5,分别来源于尼日利亚(6/15)、刚果(5/18)、科特迪瓦(2/5)、塞拉利昂(2/8)等12个国家的恶性疟病例。在2016-2019年输入的病例数中,pfpm2基因CNVs值>1.5的临床虫株数在各年度输入总数中所占比率分别为13.2%(5/38)、16.0%(4/25)、22.9%(8/35)和25.0%(6/24),各年度总虫株数的CNVs值分别为1.061±0.323、1.184±0.247、1.292±0.571和1.414±0.360。经t检验,除2017与2018年、2018与2019年之间的差异无统计学意义外,其余年度间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。来源于尼日利亚、科特迪瓦、坦桑尼亚和布隆迪4个国家的临床虫株CNVs均值显著高于总体(122个病例来源)均值(P<0.05)。结论长沙市输入性P.f的pfpm2基因CNVs值逐年提高,提示抗药性虫株有发展趋势;某些来源于西非国家的临床虫株可能产生了抗药性,提示我国疟疾防控机构要注意现行抗疟药对某些输入性恶性疟患者的治疗效果可能不佳。

弓形虫真核表达质粒pcDNA3/wx2的构建与鉴定

目的构建弓形虫新基因wx2的真核表达质粒,以其做为弓形虫DNA疫苗研究其保护性。方法PCR扩增出编码新基因wx2ORF,用EcoRI/XhoⅠ分别对扩增产物和pcDNA3进行双酶切,将wx2ORF定向克隆到pcDNA3的EcoRI/XhoⅠ位点,对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果特异扩增出预期的wx2ORF片段,大小为570bp左右,扩增产物经双酶切后成功连接到pcDNA3中,经PCR,双酶切及序列测定表明重组质粒中含有wx2读框。结论成功构建弓形虫真核表达质粒pcDNA3/wx2。

湖北钉螺人工感染、室内传代与模拟野外饲养的研究(英文)

目的:通过人工方法将湖北钉螺制备成血吸虫感染性钉螺,确定钉螺感染的最佳条件,建立钉螺人工感染传代的室内株,为研究其感染活性、遗传变异和疫苗等提供实验室依据。方法:用尼龙绢筛集卵法收集日本血吸虫成熟虫卵,常规法孵化毛蚴。将钉螺与毛蚴按不同比例进行感染,感染方式分为个体感染和集体感染。个体感染随机分6组(Ⅰ～Ⅵ组),每组200只钉螺,每只钉螺置单孔内分别感染,钉螺感染毛蚴比例分别为1:0,1:5,1:10,1:15,1:20,1:25;集体感染随机分6组(Ⅶ～Ⅻ组),每组200只钉螺,按组别集中感染,Ⅶ～Ⅻ组钉螺感染毛蚴比例分别同Ⅰ～Ⅵ组。然后对每组钉螺的感染数、死亡数及尾蚴逸出量进行比较,确定最佳感染方法和比例。以第1代人工感染性钉螺逸出的尾蚴感染实验动物,获取成熟虫卵并孵化毛蚴,然后采用个体感染方式,以1:15的比例继续感染钉螺,获得第2代人工感染性钉螺。比较第1代与第2代人工感染性钉螺的感染数、死亡数及尾蚴逸出数。通过动物感染实验,比较人工第1代、第2代感染性钉螺与自然感染性钉螺日本血吸虫成虫发育率、每克粪卵数(fecaleggspergram,FEPG)及每克肝卵数(livereggspergram,LEPG)。结果:个体感染Ⅰ～Ⅵ组的钉螺感染数分别为0±0,22.7±4.2,31.7±4.5,53.0±5.3,39.3±5.9,32.7±4.7;钉螺死亡数分别为21.7±3.1,25.0±3.6,31.3±4.9,44.7±6.5,78.3±9.5,89.7±13.6;钉螺平均逸蚴量为0±0,308.0±96.6,428.1±146.2,527.0±171.1,571.4±148.9,602.9±356.3。集体感染Ⅶ～Ⅻ组,钉螺感染数分别为0±0,12.3±2.5,18.7±4.7,28.3±4.2,33.3±4.7,29.3±5.5;钉螺死亡数分别为22.7±3.8,23.7±4.5,28.3±5.5,47.0±9.5,75.7±8.5,86.3±12.2;钉螺平均逸蚴量为0±0,244.5±57.3,292.3±74.8,347.1±100.8,477.2±142.1,447.3±161.4。用人工制备的第1代感染性钉螺对血吸虫进行人工传代研究,成功获得了人工第2代感染性钉螺,感染率为24.65%,钉螺死亡率为24.50%;与人工第1代钉螺26.65%的感染率及22.35%的死亡率差异均无统计学意义(P>0.05)。在尾蚴感染动物试验中,人工第1代、第2代感染性钉螺与自然感染性钉螺的成虫发育率分别为68.50%,73.50%,71.00%,3组间差异无统计学意义(P>0.05);自然感染性钉螺和人工第1代、第2代感染性钉螺的FEPG分别为1503±269,1683±233,1541±117;LEPG分别为6641±1819,6272±1419,7263±1643,3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:通过用人工感染的方法可以获得日本血吸虫感染性钉螺。个体感染方式优于集体感染方式,感染时钉螺与毛蚴的最佳比例为1:15。人工感染性钉螺经传代后,第1代与第2代钉螺在感染数、死亡数及尾蚴逸出数等方面无明显差别。比较人工第1代、第2代感染性钉螺与自然感染性钉螺的成虫发育率、FEPG及LEPG,差异也无统计学意义,证明人工传代的血吸虫尾蚴(室内株)能达到自然野生株尾蚴的感染效果。

双嗜性逆转录病毒感染日本血吸虫细胞的生物学理论与可行性探讨

目的探讨用双嗜性逆转录病毒载体将外源基因导入日本血吸虫(Sj)细胞的生物学理论与实验依据。方法用生物信息学方法对双嗜性逆转录病毒rRam-1受体同源性分布、结构与功能作系统的分析与比较;利用携带外源E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫培养细胞,经PCR和RT-PCR检测感染细胞目的基因(E77.43)的整合与表达。结果根据生物信息学分析结果推断,Sj细胞膜上存在的SjCHGC09605和SjCHGC05362两种蛋白为非分泌性跨膜蛋白,可能具有细胞膜离子转运通道或受体蛋白的功能及双嗜性逆转录病毒感染的膜受体样作用,可能参与病毒对细胞的吸附和穿入过程;利用携带外源E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫培养细胞后,用PCR及RT-PCR检测到目的基因整合与表达,扩增的目的片段大小为330 bp,与理论值相符。结论用载有E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫细胞获得成功,推测SjCHGC09605和SjCHGC05362两种与rRam-1受体同源的蛋白可能是Sj感染过程中起作用的分子。研究结果为下一步用双嗜性逆转录病毒载体转导永生化基因到Sj细胞提供了生物学理论与实验依据。

不同化学染色法对日本血吸虫虫卵染色的效果分析

目的探索不同化学染色法对日本血吸虫虫卵染色的效果,以期获得在镜检下可分辨虫卵和粪渣的染色方法,为粪检血吸虫虫卵的计算机自动化识别奠定基础。方法用AO-EB、罗丹明、中性红、酸性品红、甲苯胺兰、台盼蓝、考马斯亮蓝和孔雀绿等化学染料,选择3个不同浓度和2个不同温度条件,分别对含日本血吸虫虫卵粪液进行染色、涂片镜检,用虫卵和粪渣反差程度作为主要评价指标,比较各种方法的染色效果。结果在8种化学染色方法中,以AO-EB染色和中性红染色的虫卵与粪渣其反差最大,镜下粪涂片中虫卵易于辨认,AO-EB法和中性红法的检出率分别为67.5%和65.0%,明显高于改良加藤法的检出率(40.0%)。结论AO-EB法和中性红染色法有助于提高粪检血吸虫虫卵检出率。

pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB双价疫苗的构建及其免疫效果观察

目的构建日本血吸虫天然分子疫苗相关靶基因的双价疫苗pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB,并观察其免疫保护效果。方法分别以pcDNA3.0/SjRPS4、pcDNA3.0/SjCB为模板,设计引物扩增SjRPS4、SjCB,重叠PCR法将SjRPS4、SjCB拼接,扩增,经双酶切后与真核质粒载体pVAX1、pcDNA3.0连接,转化DH5α细胞,筛选阳性克隆;提取双价重组质粒、空质粒及pVAX1/SjRPS4,经左腿股四头肌注射昆明小鼠,14d后取肌肉组织切片进行间接免疫荧光及酶免疫组织化学染色,证实双价重组质粒的表达;提取pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4、pcDNA3.0/SjCB及相应空载体,100μg/只或等量PBS经左腿股四头肌注射昆明小鼠,4周后以(20±1)条尾蚴贴腹感染,6周后检测减虫率、减卵率。结果PCR、EcoRI/XhoI双酶切及测序证实双价疫苗pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB构建成功;肌肉组织间接免疫荧光及酶免疫组织化学染色证实重组质粒能够在小鼠肌肉细胞内成功表达;与PBS组相比,pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4、pcDNA3.0/SjCB免疫小鼠各组间差异均有统计学意义(P<0.05),各组与相应的空质粒组相比各指标差异亦具有统计学意义(P<0.05);两种不同载体构建的双价疫苗之间比较差异则无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建真核双价重组质粒pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB,二者免疫昆明小鼠均可以产生比单价疫苗更好的免疫保护效果。

日本血吸虫中国株次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶真核重组质粒的构建及其动物免疫保护性研究

目的克隆日本血吸虫次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(SjHGPRT)全长编码基因,研究其DNA疫苗诱导小鼠的免疫保护作用。方法将全长SjHGPRT基因克隆到真核表达载体pcD- NA3上,构建真核表达质粒pcDNA3-SjHGPRT,用经双酶切、PCR和测序鉴定正确的真核表达质粒免疫昆明小鼠3次,每次间隙2周,第3次免疫后第2周进行日本血吸虫尾蚴攻击感染,感染后42 d处死小鼠,收集成虫、肝脏和24 h粪便,计算减虫率和减卵率。结果成功构建真核表达质粒pcDNA3- SjHGPRT。动物免疫实验结果显示:pcDNA3-SjHGPRT疫苗组减虫率23.17%、肝减卵率41.64%、粪减卵率40.57%,每雌虫子宫内卵减卵率26.95%,与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。每雌虫子宫内卵减卵率及肝、粪减卯率明显高于减虫率,表明pcDNA3-SjHGPRT疫苗可能主要在抗血吸虫卵胚发育或抗生殖方面起作用。结论日本血吸虫次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶DNA疫苗可诱导抗血吸虫卵胚发育或抗生殖作用,具有潜在的疫苗研究与开发价值。

牛带绦虫病2例报告

本文报告两例牛带绦虫感染病例,其中一例国内感染,另一例系非洲埃塞俄比亚输入性感染。2例患者均采用槟榔-南瓜子法进行驱虫治疗。病例1驱虫治疗后在粪便中检获部分孕节片,查找有完整头节。病例2治疗后排出一活的完整虫体,显微镜下可见头节近方形,无顶突和小钩。治疗后2~3个月电话随访,两例患者均痊愈。

日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白全长cDNA的克隆、表达及保护性免疫评价

根据GenBank日本血吸虫(Schistosoma japonicum)琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白(SjSDISP)不完整的表达序列标签(BU804141)以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板,采用锚式PCR策略,对SjSDISP cDNA不完整的3′端和5′端进行扩增、测序,用序列比对拼接电子软件比对,基于重叠区进序列合并,获得1071bp的SjSDISP全长cDNA.序列分析推断该片段含有编码SjSDISP基因的完整阅读框,编码278个氨基酸残基.将其编码基因克隆到原核表达载体pQE30上,在大肠杆菌M15中获得准确、高效表达,表达产物分子量约为32kD.用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对表达产物进行Western blot检测,在预测位置上出现明显的识别条带.用纯化的重组蛋白rSjSDISP免疫小鼠,进行动物免疫保护性评价,在虫荷、每克肝卵、每克粪卵和每雌子宫内卵数方面,与佐剂对照组比较差异均具有显著性(P<0.05,P<0.01).结果表明,日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白酶(SjSDISP)全长cDNA成功克隆并在大肠菌中得到表达;表达产物具有良好的抗原性和动物免疫保护效果,是一种潜在的具有部分免疫保护性的抗日本血吸虫病疫苗候选分子.

东方田鼠血清识别日本血吸虫各期虫体蛋白组分的特性分析

目的进一步了解具天然抗性东方田鼠血清识别的日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)不同发育期虫体蛋白组分特性,为保护性抗原筛选提供实验依据。方法用SDS-PAGE分离Sj不同发育期虫体蛋白,经PAS染色及考马斯亮兰染色,用Western blot法观察东方田鼠血清识别Sj不同发育期虫体的蛋白组分,根据标准分子量迁移率测算各蛋白组分分子量,比较被识别蛋白组分的特性。结果东方田鼠血清对日本血吸虫4个不同发育期虫体蛋白识别的组分数量和分子量范围不尽相同,其中对子胞蚴蛋白(SSP)识别的仅有110 kDa组分,对肺期童虫蛋白(SLWP)识别的有110kDa和45～50 kDa组分,对肝期童虫蛋白(SHWP)识别的有150、110、22和14 kDa组分,与成虫蛋白(SAWP)识别的有110、80/82、90/92、45、22和14 kDa组分。在反应强度上,以识别SLWP和SHWP中的组分为最明显。这些组分与相应蛋白电泳区带与PAS染色结果比较,4个不同发育期虫体中的110 kDa组分及SAWP中45、22和14 kDa组分为糖蛋白。结论东方田鼠血清中存在天然抗Sj多种蛋白组分的抗体,识别的主要组分存在于肺期和肝期的童虫蛋白中,并具糖蛋白特性。

虎纹捕鸟蛛毒素-XVⅡa的基因克隆及在酿酒酵母中的表达

目的基因克隆和表达虎纹捕鸟蛛毒素-XVⅡa,并进行纯化和质谱鉴定。方法通过随机测序虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)毒腺cDNA文库,获得编码多肽毒素HWTX-XVⅡa的基因,对其进行生物信息学分析;构建HWTX-XVⅡa基因真核表达质粒,利用S78株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统进行分泌表达,表达产物经离子交换、反相高效液相色谱分离纯化和质谱鉴定。结果克隆得到虎纹捕鸟蛛毒素-XVⅡa的基因,构建的真核表达质粒表达产物纯化后进行质谱鉴定,为分子质量单位为3.250 004ku的虎纹捕鸟蛛毒素-XVⅡa。结论获得虎纹捕鸟蛛毒素-XVⅡa的基因及其表达产物,为研究其生物学功能奠定了基础。

一种富含半胱氨酸的蜘蛛多肽基因的克隆和初步表达

目的克隆编码虎纹捕鸟蛛多肽的基因并表达蜘蛛多肽,为研究其生物学功能奠定基础。方法通过构建和随机测序毒腺cDNA文库,克隆编码毒素多肽的基因;构建真核表达质粒,利用酿酒酵母S78株表达系统分泌表达,表达产物进行Tricine SDS-PAGE鉴定。结果克隆到一种编码富含半胱氨酸的多肽的新基因,命名为HWTX-XIVa2基因;构建的真核表达质粒转化酵母S78后表达6.5ku的多肽。结论构建并筛选毒腺cDNA文库是发现毒素多肽基因的一种有效方法,利用基因工程表达是获得蜘蛛多肽的一种有效手段。

IL-18作为疫苗佐剂的研究进展

白细胞介素-18（IL-18）是一种免疫调节因子，具有多种生物学功能，能够刺激T细胞及NK细胞产生IFN-γ、IL-12等多种细胞因子，为增强Th1型细胞介导细胞免疫的细胞因子。该文对近年来IL-18作为免疫佐剂增强疫苗免疫效果的研究进行简要综述。