细菌双杂交系统及其在病原微生物学中的应用

细菌双杂交系统是一种用于体内研究蛋白质之间相互作用的有力工具。近年来,新的细菌双杂交系统被不断地开发,并被广泛地应用于病原微生物基因产物功能和致病机制研究。本文主要就细菌双杂交系统的原理与分类,在对病原微生物蛋白质之间相互作用的识别与作用域作图、基因组范围的蛋白质之间相互作用图谱的描绘、基因工程和药物的开发中的应用以及其优缺点等方面进行综述。

鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合酶基因在生物被膜内的表达及耐药分析

目的:研究携带Ⅰ类整合子的鲍曼不动杆菌在生物被膜状态和普通液相培养状态下Ⅰ类整合酶基因(Class Ⅰ integrase gene,intI 1)mRNA的表达,并分析Ⅰ类整合子阳性菌耐药情况。方法:收集鲍曼不动杆菌临床株,并经过基因扩增筛选出携带Ⅰ类整合子的阳性菌株。提取携带Ⅰ类整合子的鲍曼不动杆菌在生物被膜和液相培养2种生长状态下的总RNA,采用半定量RT-PCR方法分析2种生长状态下细菌的Ⅰ类整合酶表达情况。并用纸片扩散法对携带Ⅰ类整合子的临床分离鲍曼不动杆菌进行药敏试验。结果:携带Ⅰ类整合子的鲍曼不动杆菌在生物被膜状态和液相培养状态下均有intI 1基因mRNA表达。但生物被膜生长状态下的intI 1mRNA表达量高于液相培养状态下表达量约4倍。在收集的64株鲍曼不动杆菌中有46株携带intI 1基因,而且Ⅰ类整合子基因盒阳性菌株的部分耐药率高于整合子基因阴性的菌株。结论:鲍曼不动杆菌在生物被膜状态intI 1mRNA的表达上调,Ⅰ类整合子在细菌耐药中发挥作用。提示整合子在生物被膜状态下可进行更活跃的基因捕获。

乳腺癌腋淋巴结微小转移与癌组织Survivin基因表达关系的研究

目的探讨乳腺癌腋淋巴结微小转移与Survivin基因表达的关系。方法采用免疫组织化学SP法对34例淋巴结常规HE染色无癌转移的乳腺癌腋淋巴结572枚进行上皮细胞角蛋白19(CK-19)表达和原发癌组织进行Survivin基因表达的检测。结果淋巴结CK-19病例阳性率为26.47%(9/34),淋巴结数阳性率为4.37%(25/572)。Survivin阳性率为32.35%(11/34)。CK-19阳性病例组中Survivin阳性率为55.56%(5/9),CK-19阴性病例组中Survivin阳性率为24%(6/25),CK-19阳性组与CK-19阴性组的Survivin阳性率无显著差异(P>0.05)。结论乳腺癌腋淋巴结微小转移的发生与癌组织凋亡抑制蛋白的表达无明显相关性。

主动外排系统作为鲍曼不动杆菌耐环丙沙星重要机制的研究

目的探讨耐环丙沙星鲍曼不动杆菌的主动外排机制。方法试管稀释法检测56株临床鲍曼不动杆菌对环丙沙星的敏感性;用直接荧光法检测耐药株在有无外排泵抑制剂时鲍曼不动杆菌胞内药物聚集浓度;结合药敏和直接荧光法两项结果筛选出6株外排抑制剂存在时胞内药物聚集浓度明显升高的环丙沙星耐药株,对该耐药组及对照敏感组做胞内环丙沙星聚集浓度的线性测定;RT-PCR法检测两组菌株主动外排泵基因adeABC的表达水平;对adeABC自身启动子区域相关基因片段进行PCR扩增并测序。结果(1)56株鲍曼不动杆菌中,48株对环丙沙星耐药(M IC>4mg/l);0株对环丙沙星中介(1mg/l≤M IC≤4mg/l);8株对环丙沙星敏感(M IC<1mg/l)。(2)耐药组药物积累量不及敏感组,加入外排泵抑制剂叠氮化钠后积累量上升并接近敏感组。(3)耐药组主动外排基因adeB的表达水平(2.372±0.032)明显高于敏感组(1.654±0.040)(P<0.01)。(4)自身启动子区域相关基因片段没有发现突变。结论鲍曼不动杆菌对环丙沙星的耐药现象非常严峻;外排泵基因adeABC的过度表达是鲍曼不动杆菌对环丙沙星耐药的重要原因;adeABC基因自身启动子区域无导致adeABC过度表达的基因突变。

耐药白念珠菌主动外排泵蛋白的功能与基因表达

目的:研究耐药白念珠菌主动外排泵蛋白的功能及其基因表达情况。方法:微量稀释法测定4种抗真菌药物对20株白念珠菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);检测罗丹明分别在对氟康唑敏感和耐药的白念珠菌中的外排情况,筛选出罗丹明6G外排明显增加的耐药菌株;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测主动外排泵基因CDR1和CDR2的表达水平。结果:在加入葡萄糖提供能量后,有些对氟康唑耐药的菌株外排罗丹明6G增加,而在这些菌株中,主动外排泵基因CDR1和CDR2的表达水平均显著高于敏感株。结论:白念珠菌对氟康唑的耐药性与主动外排泵基因过度表达相关;测定白念珠菌中罗丹明6G的外排情况,是筛选主动外排泵基因过度表达的耐药菌株的一种有效方法。

CarO蛋白与鲍曼不动杆菌耐环丙沙星的相关性研究

目的研究CarO蛋白与鲍曼不动杆菌耐环丙沙星的相关性。方法收集长沙地区四家医院的鲍曼不动杆菌56株进行药敏实验、对临床敏感株进行环丙沙星体外诱导耐药实验、PCR扩增CarO基因并测序、实时荧光定量PCR比较临床敏感株和耐药株的CarO基因表达情况。结果所收集的临床鲍曼不动杆菌对环丙沙星的耐药率达85.7%,临床敏感株被诱导成耐环丙沙星菌株后,其CarO基因序列发生了改变,且CarO基因表达量明显降低。结论 CarO蛋白表达下降与鲍曼不动杆菌耐环丙沙星有一定的相关性。

泮托拉唑对耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌主动外排泵的抑制作用

目的了解外排泵系统在鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素机制中所起的作用,观察泮托拉唑逆转鲍曼不动杆菌亚胺培南耐药的作用,为多重耐药鲍曼不动杆菌感染的治疗提供实验室数据。方法收集亚胺培南中介或耐药的鲍曼不动杆菌36株,采用琼脂平板二倍稀释法重新测定亚胺培南对实验菌株的最低抑菌浓度(MIC),同批测定加入外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)、泮托拉唑(PTZ)后抗菌药物的MIC值。结果36株实验株中加入羰基氰氯苯腙(CCCP)后亚胺培南MIC值明显降低的有13株(MIC降低4倍或以上),在这13株鲍曼不动杆菌(外排泵阳性组)中加入泮托拉唑后亚胺培南MIC值也有明显下降(P<0.05)。结论鲍曼不动杆菌杆对碳青霉烯类药物的主动外排在其耐药机制中起着非常重要的作用,外排泵阳性菌株中加入泮托拉唑后亚胺培南MIC值降低,增加了鲍曼不动杆菌对亚胺培南的敏感性,具有一定的应用前景。

HCMV IE1和pp65在人神经胶质瘤U_(251)细胞中的时序表达

目的:研究人神经胶质瘤U251细胞对人巨细病毒(human cytomegalovirus,HCMV)的容许性,并探讨病毒蛋白IE1及pp65的时序表达特点。方法:HCMV感染U251细胞,以透射电镜观察U251细胞的形态学改变,以PCR方法检测HCMV核酸,于不同的时间点分别用抗蛋白IE1及蛋白pp65单克隆抗体进行免疫细胞化学染色,检测IE1及pp65的表达水平。结果:受染的U251细胞出现了明显的形态学改变,并用PCR方法检测到了HCMV核酸。免疫细胞化学染色表明,蛋白IE1在感染后30min～2h无表达,4h开始表达,14h达高峰,随后下降;蛋白pp65在感染后1h为入侵型pp65,4～96h一直呈低水平表达,至120h表达急剧升高。结论:U251细胞是HCMV的容许细胞,HCMV在其中的表达具有时序性,但是其时序表达较在人成纤维细胞中延迟。

HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在Huh-7细胞中表达

目的构建1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)反式激活因子(Tat)基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pCDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入人体肝癌细胞系Huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Westernblot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,RT-PCR和Westernblot方法证实该质粒能在Huh-7真核细胞中有效表达HIV-1Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1Tat基因的真核表达质粒载体,并在Huh-7细胞中表达,为在Huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。

表达mIFN-γ的重组链球菌的构建及其对重组Sj-F1链球菌疫苗免疫调节作用研究

目的构建表达mIFN-γ的重组链球菌,并与重组日本血吸虫Sj-F1链球菌疫苗进行联合免疫,观察IFN-γ对重组日本血吸虫Sj-F1链球菌疫苗的免疫调节效应。方法用PCR法扩增mIFN-γ基因,亚克隆至链球菌重组质粒pGMB1,经PCR、限制性酶切和测序鉴定筛选阳性重组子。将阳性重组质粒转化链球菌载体,经抗生素抗性转化及染色体PCR鉴定筛选阳性重组链球菌。用Streak blot和Western blot分析鉴定重组链球菌的表达情况。鉴定后的重组mIFN-γ链球菌与重组Sj-F1链球菌疫苗联合应用,经滴鼻接种免疫昆明小鼠,观察诱导产生的减虫和减卵效果。结果成功构建了分泌mIFN-γ重组链球菌。Streak blot和Western blot分析表明重组链球菌能分泌mIFN-γ并可稳定遗传。免疫保护性实验表明,重组mIFN-γ链球菌与重组日本血吸虫Sj-F1链球菌疫苗联合免疫,减虫率和减卵率分别为31.56%和47.48%,与单用重组Sj-F1链球菌疫苗比较减虫率和减卵率圴增加。结论结果表明,重组mIFN-γ链球菌能增强重组Sj-F1链球菌疫苗抗日本血吸虫感染的保护力。

人巨细胞病毒UL123基因外显子4诱饵质粒的构建与鉴定

目的构建和鉴定人巨细胞病毒(HCMV)UL123基因外显子4(ie1-exon4)的诱饵质粒,并评价其用于细菌双杂交系统筛选文库的可行性。方法以重组质粒pTWIN1/ie1为模板扩增ie1-exon4,克隆入pBT质粒,转化E.coliXL1-BlueMRF’Kan,经PCR、限制性酶切和测序鉴定阳性重组子,提取阳性重组质粒,再转化入细菌双杂交系统报告菌株,诱导表达重组融合蛋白,用SDS-PAGE和WesternBlot对表达产物进行鉴定,并进一步鉴定重组子自身激活作用。结果细菌双杂交诱饵质粒pBT/ie1-exon4构建成功,并在报告菌株中表达了重组融合蛋白rIE1-C86-491/λC1,且pBT/ie1-exon4无自身激活作用。结论成功构建了无自激活作用的诱饵质粒pBT/ie1-exon4,可用于筛选文库。

人类巨细胞病毒感染致1型糖尿病机制的初步探讨

目的通过对1型糖尿病患者的HCMV感染标志物、空腹血糖、空腹C肽、胰岛素自身抗体及抗胰岛细胞抗体的研究,初步探讨HCMV致1型糖尿病的机制。方法检测1型糖尿病患者的HCMV感染标志物(包括HCMV-IgG及其相对含量、HCMV-IgM及HCMV-pp65)、空腹血糖、C肽、抗胰岛素自身抗体及抗胰岛细胞抗体并进行统计学分析。结果 HCMV感染与1型糖尿病患者抗胰岛素自身抗体之间无明显相关性,但与1型糖尿病患者空腹血糖、空腹C肽、抗胰岛细胞抗体存在明显的相关性,HCMV-pp65阳性的1型糖尿病患者中其空腹血糖明显高于该指标阴性者;抗HCMV-IgG阳性的1型糖尿病患者空腹血糖水平、抗胰岛细胞抗体均显著高于抗HCMV-IgG阴性者,而空腹C肽水平则明显低于抗HCMV-IgG阴性者,且抗HCMV-IgG抗体指数在4.1以上者,其抗胰岛细胞抗体阳性率显著高于抗HCMV-IgG抗体指数在4.0以下者。结论 HCMV感染可能通过直接损伤胰岛免疫病理反应损伤胰岛细胞最终导致1型糖尿病的发生。

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5′NCR调控荧光素酶基因的表达

目的:分析丙型肝炎病毒(HCV)5′端非编码区(NCR)的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用。方法:以质粒pCMVN CRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5′端20nt和43nt的HCV 5′NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5′NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5′NCR调控萤火虫荧光素酶(luc)基因表达的真核表达质粒(pCN1-d1、pCNl-d2)。以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平。结果:酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功。各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNRluc相比差异无显著性(P＞0．05);pCNl-dl、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性(P＞0．05)。结论:HCV 5′NCR的5′端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性。

丙型肝炎病毒5'端非编码区结构域Ⅰ、Ⅱ在其翻译启动活性中的作用具有细胞特异性

目的分析在不同宿主细胞的翻译体系下,缺失不同片段的HCV 5'UTR翻译启动活性的差异。方法以脂质体介导基因转染技术,将截短型HCV 5'UTR调控Fluc的真核表达质粒与Rluc真核表达质粒p RL-TK共转染至不同的细胞中,转染后36 h:6提取细胞RNA,半定量RT-PCR检测目的质粒的转录水平;6用双荧光素酶报告基因检测系统检测Fluc基因相对表达活性,分析HCV 5'UTR缺失不同结构域后在不同翻译体系中翻译启动活性的差异。结果 6缺失5'端44个碱基的HCV 5'UTR的翻译启动活性分别与缺失前相比:在He La细胞和C6细胞中无明显影响,在L-02细胞中活性下降为46%,而在293T细胞则为缺失前的146%;6缺失5'端118个碱基后,HCV 5'UTR的活性分别与缺失前相比:在He La细胞中,缺失后活性仅为缺失前的49%,而在L-02细胞、C6细胞和293T细胞中,活性分别为缺失前的140%、160%和235%。在本研究使用的四种细胞中,p CNl的翻译启动活性的差异无统计学意义,p CNl-d2在293T细胞中活性最高,在L-02细胞中活性最低。p CNl-d3在293T、C6和L-2细胞中活性相近,但在He La细胞中的活性明显比其他细胞低。结论 HCV 5'UTR的DomainⅠ和DomainⅡ对其翻译启动活性的影响与宿主细胞种类相关,具细胞特异性。

疱疹病毒与宿主细胞骨架间的相互作用

疱疹病毒依赖于宿主细胞骨架有效地进入细胞、复制以及从细胞中释放出来。为促使这一过程顺利完成，在细胞质和细胞核中，病毒蛋白必须与宿主细胞分子马达相互作用，以便使病毒在感染细胞中正确定位。本文就疱疹病毒如何利用宿主细胞骨架、相关的分子马达和重塑蛋白将复杂的病毒结构高效地转入或转出细胞进行简要综述。

norA基因mRNA表达水平与表皮葡萄球菌氟喹诺酮耐药性的关系

目的:探讨表皮葡萄球菌多药转运蛋白norA基因表达水平与氟喹诺酮耐药性的关系。方法:收集临床分离表皮葡萄球菌菌株,用纸片扩散法(Kirby-Bauer)检测50株表皮葡萄球菌对抗菌药物的敏感性,筛选出耐药和敏感菌株,以标准菌株ATCC12228作为对照;提取表皮葡萄球菌的总RNA,应用荧光实时定量RT-PCR检测表皮葡萄球菌多药转运蛋白norA基因mRNA表达水平。结果:所有菌株均检测到norA基因,临床分离耐药菌株norA基因mRNA表达水平明显高于敏感菌株,统计学分析差异有显著性(P<0.05)。结论:对氟喹诺酮类耐药的表皮葡萄球菌norA基因过度表达,其可能是表皮葡萄球菌耐药的原因之一。

鲍曼不动杆菌耐药程度与其主动外排泵蛋白的相关性研究

目的:探讨鲍曼不动杆菌耐药程度与其主动外排泵蛋白的相关性。方法:首先用纸片扩散法检测64株临床鲍曼不动杆菌对8种抗菌药物的敏感性;将其分为A组(0～2种抗生素耐药)、B组(对3～5种抗生素耐药)和C组(对6～8种抗生素耐药);检测64株临床鲍曼不动杆菌对罗丹明6G的外排情况,筛选出罗丹明6G外排明显增加的菌株;并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测主动外排泵基因AdeABC的表达水平。结果:64株鲍曼不动杆菌中有4株对0～2种抗生素耐药(A组),对3～5种抗生素耐药的有33株(B组),对6～8种抗生素耐药的有27株(C组);多重耐药组鲍曼不动杆菌罗丹6G外排明显增高,外排程度A组<B组<C组;罗丹明6G外排增强的多重耐药不动杆菌主动外排泵基因AdeABC的表达水平显著增高。结论:鲍曼不动杆菌的耐药现象严峻;多重耐药性与药物主动外排增强有关;AdeABC基因的过度表达是鲍曼不动杆菌药物外排增加的重要原因。

丙型肝炎病毒5’端非编码区结构域Ⅱ在其翻译启动活性中的作用

目的分析丙型肝炎病毒（HCV）5’端非编码区（NCR）的结构域Ⅱ序列（nt44—118）在其翻译启动活性中的作用。方法用PCR扩增技术获得缺失5’端118nt的截短型HCV5’NCR片段，并以之替换萤火虫荧光素酶（Fluc）真核表达质粒pCMVNCRluc中的完整HCV5’NCR，构建截短型HCV5’NCR调控Fluc基因表达的真核表达质粒pCNl-d3。将pCNl-d3、pCMVNCRluc和pCMVNCRluc缺失HCV5’NCRntl-43后的重组质粒pCNl-d2以脂质体方法分别转染人肝癌细胞株HepG2，用双荧光素酶报告基因检测系统检测Fluc相对表达活性，RT-PCR检测FlucmRNA的相对表达水平。结果酶切和测序结果表明，重组质粒构建成功。各质粒转染细胞后FlucmRNA的相对表达水平差异无统计学意义（P〉0．05）；pCNl—d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无统计学意义（P〉0．05），pCN1-d3的Fluc活性显著低于pCMVNCRluc（P〈0．01）。结论HCV5’NCR的结构域Ⅱ（nt44—118）含有其发挥翻译启动功能的重要序列。

呼吸道合胞病毒感染的免疫应答效应

人呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial vires，RSV）是婴幼儿毛细支气管炎的主要病原体，RSV感染是导致儿童以及老年人和免疫缺陷的成年人患病和死亡的主要原因。近来，越来越多的研究发现天然免疫应答以及炎症的异常调节是导致病毒感染后出现病理学效应的重要原因。被动免疫抗体能对感染起一定的预防作用，但自然感染RSV诱发的抗体水平的保护作用较差。RSV感染后机体的免疫应答仍需进一步研究，以加速相关疫苗及毛细支气管炎新疗法的研发。

含EGFP报告基因单顺反子HCV亚基因组复制子载体的构建和表达

目的构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的HCV复制子表达载体,并实现其在细胞中的复制表达。方法用分子生物学基因克隆技术对HCV 2a型复制子的基因进行改造,用EGFP基因替代HCV基因组中的包膜基因(E1和E2)体外构建重组单顺反子HCV亚基因组复制子真核表达质粒pcDNA-JFH1-EGFP,经限制性内切酶酶切分析和测序鉴定;脂质体介导转染人肝癌细胞系Huh-7细胞,用荧光显微镜观察EGFP表达,采用半定量RT-PCR方法检测重组复制子的HCV RNA负链,采用Western blot检测HCV NS3蛋白的复制表达,并观察IFN-α对重组质粒表达的HCV RNA复制的抑制作用。结果构建的4个重组质粒酶切分析与预期相符,HCV亚基因复制子表达载体中未发生EGFP和HCV编码区读码框架改变,转染重组载体Huh-7细胞检测到HCV负链及EGFP和HCV NS3蛋白表达。转染后48h,1 000IU/ml和2 000IU/ml IFN-α处理的细胞HCV RNA表达水平分别为未处理组的20.0%和7.6%。结论含EGFP报告基因的单顺反子HCV亚基因组复制子表达载体pcDNA-JFH1-EGFP构建成功,在Huh-7细胞中能有效复制表达,为进一步研究HCV提供了实验平台。