鼻咽癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

构建人鼻咽癌组织cDNA文库 ,以SEREX方法从cDNA文库中筛选鼻咽癌抗原基因。采用确诊鼻咽癌患者新鲜活检癌组织构建cDNA文库 ,测定原始文库滴度 ,进行蓝白筛选以确定文库的重组率。以建库组织来源患者的自身血清 ,采用“一对一”的血清学方法筛选所构建的cDNA文库 ,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析。经测定原始文库滴度为 7 2 8× 10 6 pfu mL ,含 3 6 4× 10 6 个重组子 ,重组率为 94 % ,扩增文库滴度为 3 8× 10 9pfu mL ,cDNA插入片段大小在 0 5～ 3 0kb之间。文库经三轮血清学筛选共获得 2 3个阳性克隆 ,分别代表了 16个独立的cDNA插入片段 (抗原基因 )。其中 10个与已知基因高度同源 ,另外 6个基因与GenBank中已知基因的部分同源 ,其中有 3个是新基因。利用SMART技术构建了高质量的人鼻咽癌组织cDNA表达文库 ,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究。应用SEREX技术初步筛选鼻咽癌组织cDNA文库 ,共得到 16个鼻咽癌相关抗原基因 ,其中有 3个是新基因 ,可能为鼻咽癌的免疫学研究提供新的研究分子。

人鼻咽癌组织定向cDNA文库的构建

目的 快速构建成人鼻咽癌组织cDNA文库。方法 从人鼻咽癌组织分离总RNA ,以含有sfiIB酶切位点的oligo(dT)引物合成第一链cDNA ,以含sfiIA酶切位点的SMART寡核苷酸为引物经LD PCR扩增双链cDNA ,双链cDNA经sfiI(IA&IB)酶切 ,以CHROMASPIN 4 0 0柱分级分离cDNA ,收集符合需要的cDNA片段并纯化 ,随后将之与λTriplEx2载体连接经体外包装成噬菌体cDNA文库。 结果 经检测共获得 3.6 4× 10 6个重组子 ,重组率 >94 % ,文库经扩增后滴度为 3.8× 10 9pfu/ml。结论 用SMART方法构建的鼻咽癌组织cDNA文库质量较高 。

鼻咽癌细胞HNE_2cDNA文库的构建

目的 快速构建人鼻咽癌细胞株HNE2 的定向cDNA文库。方法 从人鼻咽癌细胞抽提总RNA磁珠法分离mRNA ,以含SfiI酶切位点的oligo(dT)引物合成cDNA第一链 ,利用SMART(switchingmechanismat 5’endofRNAtranscript)技术 ,经LD -PCR合成双链cDNA ,该物经SfiI酶切后分级分离 ,插入片段与λTripIEx2载体连接经体外包装成噬菌体cDNA文库。结果 经鉴定 ,该文库含0 78× 10 6 个重组子 ,重组率 >96% ;扩增文库滴度为 1 0 2× 10 9pfu/ml ,插入片段平均长度为 1 2kb。结论 构建的人鼻咽癌细胞HEN2 cDNA文库质量较好 。