造血干细胞体外扩增方法研究进展

造血干细胞具有自我更新和多向分化的潜能,能够发育为血液系统和免疫系统。脐带血作为造血干细胞的主要来源,成为近年来的研究热点。但单份脐带血中,造血干细胞的数量有限,不能支持成年人的造血重建,需要进行体外扩增。造血干细胞体外扩增的方法有很多,现就造血干细胞体外培养方法的研究进展予以综述。

Wnt3a和Activin A共同促进人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化

【目的】研究Wnt3a和ActivinA存限定性内胚层诱导中共同作用的最佳时间窗。【方法】在无饲养层体系培养的人胚胎于细胞中，加入25ng／mLWnt3a和100ng／mLActivinA，共同作用不同时间（1～4d），收集不同作用时间点（0，1，2，3，4，5d）细胞，对原条、内中胚层前体标记Brachyury及限定性内胚层标记Sox17分别进行免疫荧光染色，统计阳性细胞总数，计算阳性细胞率。以看家基阕β-actin作为对照，采用RTPCR方法对原肠作用基因（Goosecoid（GSC）、Mixll）及三胚层发育相关基因（内胚层基因Sox17、Foxa2，内中胚层前体基因Braarchyury，中胚层基因Flk-1，外胚层基闪Pax6，胚外内胚层基因Sox7、CDX2）的表达进行检测。【结果]Wnt3a与ActivinA共同作用1～4d，均能获得限定性内胚层细胞，其中二者共同作用1d分别能获得（78．9±7．3）％Brachyury阳性细胞和（85．2±3．8）％的Sox17阳性细胞。RTPCR结果显示，在Wnt3a与ActivinA共同作用下，原肠作用基因及三胚层发育相关基因表达的时间有差异。【结论】Wnt3a和ActivinA共同作用1d，是有效促进人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化的最佳作用时间窗。

诱导人孤雌胚胎干细胞分化为胰岛样细胞团

背景:随着人类孤雌胚胎干细胞系的成功建立,对该细胞的进一步分化功能研究成为新的研究热点。目的:研究体外培养的人类孤雌胚胎干细胞诱导分化为胰岛样细胞团的潜能。方法:自主建系孤雌来源人胚胎干细胞和正常来源人胚胎干细胞各1株,运用基于胰腺体内发育规律的改良5阶段诱导法诱导人孤雌胚胎干细胞为胰岛样细胞团,加入不同生长因子及诱导试剂对人胚胎干细胞分5阶段序贯培养。结果与结论:终末分化细胞光镜下呈团状聚集,RT-PCR、免疫荧光染色检测分化细胞表达胰岛细胞特征性的基因与蛋白。胰岛素释放实验提示获得的细胞具有胰岛样生化功能。由人类孤雌胚胎干细胞来源的胰岛样细胞团具备胰岛的基本特征,是未来治疗1型糖尿病的可用材料。

粒-巨噬细胞集落刺激因子对小鼠体内树突状细胞增殖和活化的影响

目的:研究粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在体内对树突状细胞(DC)增殖和活化的影响。方法:将Balb/c小鼠随机分为GM-CSF处理组和对照组,致死量γ射线照射后移植入绿色荧光蛋白(GFP)标记的骨髓来源的造血干细胞(HSC),GM-CSF处理组隔天皮下注射0.1μg直至处死,对照组隔天皮下注射PBS。应用流式细胞仪分析和比较两组移植后1,2,3及4周小鼠脾脏内DC的数目、活化状态和随时间变化的DC动力学。结果:移植后各时间点GM-CSF处理组小鼠脾脏内DC数目明显高于对照组(均P<0.05),其中最大高出倍数为5倍;GM-CSF处理组DC的CD40,CD80和CD86均高于处理组;骨髓移植后第1周,小鼠脾脏内即出现HSC来源的DC,第2周数目开始上升,至第3周达到高峰,第4周开始下降。结论:GM-CSF对体内HSC分化为DC具有促进作用,并且可促进体内DC的成熟与活化。

不同培养体系可逆改变人类胚胎干细胞的分化倾向

背景:人类胚胎干细胞可以在饲养细胞依赖性培养体系和化学限定性培养体系下维持未分化状态,能够在体内外诱导分化成三胚层来源的细胞类型。目的:比较饲养细胞和化学限定性培养体系对人类胚胎干细胞特性的影响。方法:将在饲养细胞培养体系下培养27代的人类胚胎干细胞转入到化学限定性培养基体系中培养56代,然后再将其转回到饲养细胞培养体系中,将3种培养条件下的人类胚胎干细胞(饲养细胞培养体系培养70代、化学限定性培养体系培养56代、化学限定性培养体系下培养70代后转回饲养细胞培养体系下培养13代和20代)进行多能性分子标记SSEA4流式分析等检测分析,同时对3种培养条件下人类胚胎干细胞经拟胚体诱导分化后分别检测多能性基因和三胚层分化基因的表达。结果与结论:人类胚胎干细胞在饲养细胞和化学限定性培养体系下表现出不同的诱导分化倾向,在化学限定性培养体系下表现出向神经诱导分化抑制,这种不同的诱导分化倾向可发生可逆性转换,当人类胚胎干细胞由化学限定性培养体系转回到饲养细胞培养体系时,诱导分化倾向表现出与其在饲养细胞下诱导分化一致的模式。在拟胚体分化中,多能性基因Nanog高可能对诱导分化倾向起着重要作用。与此同时,人类胚胎干细胞SSEA4细胞亚群发生相应的变化,人类胚胎干细胞在饲养细胞和化学限定下培养体系下表现的分化倾向与人类胚胎干细胞亚群所占的比例存在关联。

Activin A特异性对人胚胎干细胞向限定性内胚层诱导分化的促进作用

【目的】研究Activin A对人胚胎干细胞(hESCs)向限定性内胚层(DE)诱导分化的促进作用及其信号通路分子,为hESCs向DE诱导分化体系的优化提供参考。【方法】在人饲养层体系培养的hESCs中,收集100ng/mL Activin A分别诱导0,6,12,24,48,72,96,120h的细胞,用实时荧光定量RT-PCR检测原条标记Gsc和Mixl1、中内胚层共同前体标记Brachyury、内胚层标记Foxa2和Sox17、中胚层标记Flk1、外胚层基因Pax6、多能性相关基因Oct4与Nanog表达水平的变化,用细胞免疫荧光检测Brachyury和Sox17蛋白表达水平的变化。【结果】在人饲养层(HEF)培养体系上,高浓度Activin A能更快地促进中内胚层基因的表达并提高其表达水平;Brachyury和Sox17蛋白的细胞免疫荧光检测表明,Activin A诱导12和48h就可检测二者的表达明显增加,且二者的表达水平分别在诱导48和96h时达到高峰;hESCs高效分化为限定性内胚层细胞,DE细胞分化率为(81.7±5.4)%,并且体外的内胚层分化过程遵循从原条开始、经过中内胚层共同前体阶段、再到内胚层的发育过程,与体内发育规律相似。【结论】Activin A能特异性地诱导人胚胎干细胞向限定性内胚层分化,转录调控Brachyury和Sox17蛋白的表达。

不同剂量碱性成纤维细胞因子对人类胚胎干细胞生长、凋亡和DNA完整性的影响

目的探讨碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)浓度对人类胚胎干细胞(human embry-onicstem cells,hESCs)特性的影响。方法建立化学限定性hESCs培养体系,以有饲养细胞培养体系作为参照,比较4、40ng/ml和100ng/mlbFGF对hESCs多能性标记、细胞周期、细胞凋亡和DNA完整性的影响。结果①低浓度bFGF(4ng/ml)足以维持hESCs在化学限定性培养基(基础培养基DMEM/F12,N2,B27,简称NB体系)中培养;②bFGF可以抑制hESCs细胞凋亡,且具有剂量依赖性,而对hESCs细胞周期没有影响;③bFGF有助于hESCsDNA完整性维持,在NB体系加入4ng/mlbFGF时,hESCs在DNA水平上存在75个异常区域,而在加入40ng/mlbFGF时,只存在1个异常区域。结论高剂量bFGF有助于hESCs体外快速扩增和hESCsDNA完整性维持。提高bFGF浓度为hESCs体外培养所必需。

无饲养细胞无外源因子条件下高克隆密度维持人类胚胎干细胞自身未分化状态(英文)

目的:建立人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)无饲养细胞无外源性细胞因子体外培养体系。方法:比较hESCs克隆种植密度对其无饲养细胞无外源性细胞因子体外培养的影响,以及克隆种植密度对hESCs培养体系骨形蛋白(bone morphology protein,BMP)样诱导活性的影响。结果:在没有外源性细胞因子条件下,高克隆密度(34克隆/cm2)可以维持hESCs处于未分化状态,而低克隆密度不能维持hESCs处于未分化状态。同时,NB体系BMP样诱导活性可以被hESCs克隆种植密度所改变,高hESCs克隆密度时,培养基具有高的BMP样诱导活性。结论:高hESCs克隆种植密度可以改变自身生长的微环境,可以维持自身未分化状态,这为阐明hESCs自身未分化状态机制和简化hESCs无饲养培养体系提供了新的思路。

利用化学小分子实现人胚胎干细胞多能性状态的转化

小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)具有两种不同的多能性状态-原始态多能性(naive pluripotency)和始发态多能性(primed pluripotency),这两种多能性干细胞在形态、自我更新维持条件、基因表达、表观遗传学特征以及单克隆形成率等方面都存在明显差别。传统条件下分离和培养的人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,h ESCs)生物学特征更接近始发态多能性状态,需依赖转基因操作才能获得和维持原始态多能性状态。本研究通过在培养体系中添加化学小分子成功地将已建系的始发态多能性h ESCs转化为原始态多能性干细胞,转化后h ESCs呈紧密、圆形、隆起的三维克隆结构,具有两条活化的X染色体,单克隆形成率提高,基因表达更接近原始态多能性特征。结果提示h ESCs也存在两种多能性状态,不同的体外培养环境可获得具备不同多能性特征的h ESCs。原始态多能性状态的获得使h ESCs在基因治疗、器官再生等领域具有广阔的应用前景,而仅改变培养条件,不依赖基因操作的培养方式大大提高了原始态多能性干细胞应用的安全性。

不同人胚胎干细胞系向限定性内胚层分化能力存在差异

研究不同的人胚胎干细胞系向限定性内胚层细胞分化能力是否存在差异,并尝试寻找造成差异的原因。基于已建立的人胚胎干细胞库资源和限定性内胚层定向诱导分化体系,流式检测诱导分化3天后10株细胞系Sox17的阳性比率发现其值在60%到80%之间波动,而SSEA4的阳性比率在人胚胎干细胞系中不存在明显差异。基因表达谱结果显示像Sox17,Foxa2等内胚层标记在这些细胞之间不存在显著的差异,而像MEG3和SNORD114-3在差异细胞系之间和同株细胞早晚期代数之间存在表达差异。结果提示不同的人胚胎干细胞系向限定性内胚层细胞分化能力存在着差异,推测这些差异可能与MEG3和SNORD114-3的差异表达相关。

从植入前遗传学诊断异常的胚胎中分离人胚胎干细胞系

在体外受精过程中,通过胚胎植入前遗传性诊断(PGD)对有遗传风险患者的胚胎进行植入前活检和遗传学分析,选择无遗传性疾病的胚胎植入子宫,而PGD诊断异常的胚胎则会被丢弃。本研究尝试将PGD异常胚胎用于分离人胚胎干细胞,以获得携带遗传缺陷的人胚胎干细胞系。利用荧光原位杂交技术对第3-5天胚胎进行PGD检测,结果异常的胚胎进一步用于分离获取胚胎干细胞系,然后对h ES细胞系进行核型及干细胞表面标记、多能性基因表达、端粒酶活性以及分化能力等特征性鉴定。总共从13个PGD异常胚胎中分离获得8个人胚胎干细胞系,建系效率为61.5%,其中1个核型正常,5个核型异常。说明利用PGD异常胚胎可以获得携带遗传缺陷的人胚胎干细胞系,不仅为评估PGD技术临床结论的准确性提供了一种新方法,更重要的是为研究各种遗传性疾病的发病机理提供了有效的细胞模型。

小鼠睾丸不同阶段生精上皮细胞的发育形态学研究

目的:研究小鼠生精上皮各类细胞发育过程中形体学特征以及异常发育的生精细胞形态方法:PAS染色正常成年小鼠睾丸,通过光学显微镜观察每种上皮细胞的形态学特征。结果:小鼠生精上皮分为Stage I-XII不同阶段,在精子细胞分化、分裂的同时呈现出动态变化,生精上皮中的精子细胞包括精原细胞、减数分裂间期细胞(L、Z、P、D)、次级精母细胞、圆形精子细胞、长形精子细胞。每种细胞都具有明显形态学特征。结论:根据生精上皮细胞的形态特征可以判断小鼠不同类型精子发育是否正常,对于利用小鼠动物模型来研究生殖系统功能的研究有重要意义。

生长激素在卵巢低反应患者中的应用研究

目的探讨生长激素对控制性超排卵中卵巢反应低下的患者的应用价值。方法将38例符合卵巢反应低下的不孕症患者,随机分为生长激素组(21例)和对照组(17例),均采用短方案降调节,其中生长激素组从周期第2～3 d每天注射4IU生长激素直至HCG日,比较两组超排卵过程及结局。结果两组的一般情况无明显差异;两组超排过程中的各项参数,包括各时期内分泌结果、促性腺激素的使用时间、剂量、获卵数、受精率、卵裂率、优质胚胎率以及移植胚胎数目均无显著性差异,最终GH组获得了42.1%的临床妊娠率,而对照组仅为13.3%。两组中,超排周期第二天血清GH、抑制素、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ及IGFBP3水平均无显著差异;超排周期第6天两组患者的抑制素水平无显著差异;注射HCG日中,GH组血清IGF-Ⅰ水平较对照组显著增加(P<0.000);IGF-Ⅱ水平在两组间无显著差异;GH组血清IGFBP3水平较对照组显著下降(P<0.000);两组患者卵泡液中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ及IGFBP3水平均无显著差异。结论在卵巢低反应患者中,在促排过程中加用生长激素可以显著提高血中IGF-Ⅰ水平,降低IGFBP3水平,妊娠率有上升趋势。

改良超长方案改善卵巢低反应患者IVF/ICSI妊娠结局:一项自身对照研究

目的探究卵巢低反应患者在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)中采用拮抗剂方案失败后应用改良超长方案的效果。方法回顾性分析2013年12月至2015年2月我院生殖中心卵巢低反应患者(n=63)拮抗剂方案助孕未孕与之后行改良超长方案(n=63)的自身对照。比较两种方案注射HCG日LH、孕酮(P)、雌二醇(E2)的水平、P/E2比值,HCG日LH>5U/L和LH>10U/L的发生率、子宫内膜厚度,促排天数、用药量、平均获卵数、受精率、优胚率,且统计改良超长方案组着床率、临床妊娠率等。结果与拮抗剂方案组相比,改良超长方案组HCG日LH、P、P/E2比值、HCG日LH>5U/L和LH>10U/L发生率均显著下降(P≤0.001),而促排天数、促排用药量显著增加(P<0.001)。虽其他指标无明显差异,但改良超长方案组受精优胚率显著增加(P=0.041)。改良超长方案组着床率42.86%,临床妊娠率61.11%。结论卵巢低反应患者采用拮抗剂方案失败后应用改良超长方案有助于改善妊娠结局。

卵巢早衰候选基因的突变研究进展

卵巢早衰病因复杂,多数病例病因不明。在已知的病因中,遗传因素非常重要。卵巢早衰不但可导致不孕症,患者的低雌激素水平还增加了患骨质疏松症和冠心病的危险。目前临床上的主要治疗措施包括激素替代治疗和供卵治疗不孕症等,但效果都不理想。鉴定卵巢早衰的致病基因是从根本上治疗和预防该病的基础。目前已发现在X染色体上和常染色体上多个基因与之相关,文章综述了近年来对卵巢早衰候选基因的突变分析情况,旨在从分子水平分析研究卵巢早衰的发病机制提供基础。

视黄酸促进限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞分化

研究视黄酸(RA)在限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞诱导过程中的最佳作用方式。在无饲养层培养体系下联合多因子分阶段诱导经历10天时间获得胰腺前体细胞。获得的细胞不仅表达胰腺前体细胞的标记pdx1,但是也同时表达肝脏前体细胞的标记afp。有研究表明在胰腺特化过程中RA能起到抑制afp的作用,因此在不同的时间点添加RA并持续不同的作用时间来调节内胚层细胞向肝胰分化的命运。收集d7到d10的细胞用免疫组化和RT-PCR检测pdx1和afp的表达情况。结果显示RA从d3开始持续作用到d10可以获得更高的pdx1阳性细胞同时能有效的抑制afp的表达,并且在d9可以获得最高比率的pdx1阳性细胞,提示RA持续作用促进限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞分化。

Down's综合征相关基因克隆的研究进展

Down’s综合征是最常见的一种染色体数目异常,是导致先天性智力障碍的重要原因之一。寻找Down’s综合征的相关基因是阐明其发病的分子机制的关键步骤。本文综述了Down’s综合征相关基因的筛选策略、基因克隆方法、已克隆的重要相关基因以及在Down’s综合征动物模型研究方面的新进展。

蔓越莓沙棘复合粉对男性精子质量影响的研究

目的研究蔓越莓沙棘复合粉是否能改善精子质量相关参数,为通过食物改善男性生殖健康提供思路。方法纳入符合入选标准和排除标准的志愿者共106例,年龄范围18岁～51岁,BMI指数(18.4～34.2)kg/m^2。分别在受试者服用蔓越莓沙棘复合粉的第一阶段、第二阶段和第三阶段,检测精液常规、精子形态、精子DNA完整性及精浆生化等指标。利用统计软件SPSS18.0分析志愿者各阶段精液参数。结果完成第二和第三阶段的志愿者分别是78和52例。①与服用前相比,服用至第二和第三阶段,志愿者前向运动精子百分率从[(26.26±10.47)%升高至(34.76±14.63)%和(34.16±13.32)%],服用至第三阶段,精子浓度从[(40.99±31.91)×10~6/ml升高至(48.23±30.44)×10~6/ml]和精子形态从[(4.38±3.08)%升高至(4.87±3.25)%],得到改善,具有统计学意义。尤其是部分少精子症和弱精子症志愿者,服用一段时间后,少精子症志愿者精子浓度[(8.27±4.64)×10~6/ml升高至(23.78±21.32)×10~6/ml,差异具有统计学意义(P<0.05)];弱精子症志愿者前向运动精子百分率[(22.01±6.16)%升高至(32.85±13.46)%,差异具有统计学意义(P<0.001)]均值达正常范围。②服用蔓越莓沙棘复合粉后,志愿者精子DNA完整性和精浆生化与服用前相比,无统计学差异(P>0.05)。结论①已有结果提示蔓越莓沙棘复合粉能在一定程度上改善精子浓度、精子活力和形态,尤其提高精子浓度和前向运动精子百分率;②服用蔓越莓沙棘复合粉不影响精子DNA完整性和精浆生化。然而其明确结果还有待进一步扩大样本量加以验证。

siRNA靶向稳定干扰HDGF基因胃癌细胞株的建立

目的构建针对肝癌衍生生长因子(HDGF)基因的siRNA表达载体,建立稳定干扰HDGF表达的胃癌细胞株。方法常规聚合酶链反应(PCR)检测HDGF基因在胃癌SGC-7901细胞株的表达情况。构建重组靶向HDGF shRNA慢病毒表达质粒pLentiU6/HDGFshRNA,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞株。经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株。荧光定量PCR检测干扰效率。结果在胃癌SGC-7901细胞株中,HDGF显示高表达。测序验证pLentiU6/HDGFshRNA重组质粒构建成功;在将干扰表达质粒稳定转染入胃癌细胞株后能明显抑制HDGF mRNA表达水平。结论成功构建了pLentiU6/HDGFshRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰HDGF表达的siRNA胃癌细胞株。

应用供精冷冻精液出生子代的安全性分析

目的:调查使用供精者精液行辅助生殖技术(ART)后的妊娠结局,探讨应用供精冷冻精液出生子代的安全性。方法:2006年1月至2012年12月我院人类精子库向全国31家生殖中心提供冷冻精液,共治疗50 247个周期。统计使用供精精液行宫颈内人工授精(ICI)、宫腔内人工授精(IUI)、体外受精(IVF)及卵细胞胞质内单精子注射(ICSI)的子代出生缺陷发生率及自然流产率,对比不同授精方式的出生缺陷率与自然流产率的差异。结果:使用供精者冷冻精液行人工授精39 047个周期,其中ICI周期数36 674个,临床妊娠8 612例,自然流产917例,自然流产率(<28孕周)10.6%(917/8 612);活胎数6 133例,发生出生缺陷者43例,出生缺陷发生率0.70%(43/6 133)。IUI周期数2 373个,共获得临床妊娠547例,自然流产41例,自然流产率为7.5%(41/547);活胎数426例,发生出生缺陷2例,出生缺陷率0.47%(2/426)。使用供精者冷冻精液行IVF、ICSI治疗共计11 200个周期,其中IVF临床妊娠5 860例,自然流产456例,自然流产率7.8%(456/5 860),活胎数5 089例,出生缺陷发生率1.08%(55/5 089);ICSI临床妊娠350例,自然流产30例,自然流产率8.6%(30/350),活胎数229例,出生缺陷发生率1.31%(3/229)。使用供精冷冻精液出生的后代缺陷发生率显著低于我国卫生部发布的监测数据(0.86%vs 1.53%,P<0.01)。结论:供精冷冻精液出生子代的安全性仍在可控的范围。