人CUL4A重组腺病毒载体的构建及其在PC-12细胞中的表达特点

目的构建并鉴定带有绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）报告基因的人源CUL4A（hCUIAA）基因腺病毒表达载体Ad—hCUIAA—GFP，探求bCUIAA在PC-12细胞中的表达特点。方法扩增hCUIAA基因，并通过In—FusionPCR克隆技术构建穿梭质粒pDC315-EGFP—hCUIAA，利用AdMaxTM腺病毒包装系统将该穿梭质粒与腺病毒表达载体骨架质粒pBHGloxAEl，E3Cre共转染HEK293细胞，经GFP荧光检测和Western印迹检测确认hCUIAA的表达后，进一步通过病毒扩增及纯化得到hCUL4A重组腺病毒载体Ad—hCUIAA—GFP。将该载体转染Pc—12细胞，观察hCUIAA—GFP融合蛋白在Pc-12细胞中的表达情况。结果成功获得了较高滴度的腺病毒载体Ad—hCUIAA—GFP（1．6×10^12pfu／m1）。荧光检测表明，Ad—hCUIAA—GFP转染Pc-12细胞后72h内，病毒转染率随着时间和病毒转染滴度的增加而增加。DAPI细胞核荧光染色结果表明，hCUIAA—GFP的表达主要集中在细胞质部分。GFP荧光检测及Western印迹检测结果显示，hCUIAA—GFP在Pc-12细胞中的表达量随时间和病毒转染滴度的增加而增加。结论带GFP的hCUIAA重组腺病毒载体Ad—hCUIAA—GFP构建成功，掌握了其转染Pc-12细胞的最佳滴度及其在Pc-12细胞中的时空表达特点，为今后对hCUIAA在PC-12细胞中的功能性研究奠定了基础。

CUL4A作用机制研究进展

Cullin4A(CUL4A)是泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)中泛素E3连接酶家族的重要成员之一。UPS是细胞内蛋白降解的重要途径,越来越多的证据表明CUL4A可以通过CUL4A-DDB1-E3途径调节细胞中的一些功能蛋白质,产生相应的作用。本文就CUL4A在基因组的稳定、细胞周期的调控、恶性肿瘤的发生发展、胚胎发育、造血干细胞及脑缺血性损伤等方面的作用进行综述。