脐血有核细胞输注治疗慢性肝衰竭的初步临床观察

目的探讨人脐血有核细胞移植(HUCBNCT)治疗慢性重型肝炎肝衰竭的临床治疗效果,以及HUCBNCT对重型肝炎患者肝组织内胆管增生及肝卵圆细胞增生的影响。方法将90名慢性重型肝炎患者随机分为2组,分别予以同血型成人血浆(对照组)或HUCBNCT(治疗组)治疗,2组中分别有部分患者行肝穿刺病理检查及肝组织细胞角蛋白19(CK19)、CD34、白蛋白和甲胎蛋白(AFP)检测。结果HUCBNCT组患者肝细胞坏死较轻,肝组织CK19阳性率高于对照组;部分非典型胆管增生细胞同时表达CK19和白蛋白,在形态上和细胞表型上符合肝卵圆细胞特征。结论HUCBNCT对于慢性重型肝炎具有一定的疗效,在改善肝脏功能方面优于同血型成人血浆,其促进慢性重型肝炎患者肝组织内非典型胆管细胞增生及肝卵圆细胞增生可能是其作用机制之一。

黄芪注射液促进脐血干细胞向肝细胞分化 具有增强移植干细胞治疗大鼠肝衰竭的效果

背景:在脐血干细胞移植治疗肝功能衰竭研究中,文献报道黄芪制剂可刺激造血干/祖细胞的增殖。目的:观察黄芪注射液在体内外促进脐血干细胞向肝细胞的分化,以及增强脐血干细胞移植治疗大鼠肝衰竭的效果。方法:取传至三四代的人脐血干细胞,药物筛选实验设立4组,分别加入0,40,200,400mg/L黄芪,筛选适宜脐血干细胞生长的黄芪浓度;干细胞分化实验设立2组,分别加入肝细胞生长因子10μg/L、肝细胞生长因子10μg/L+黄芪200mg/L。采用腹腔内注射D-氨基半乳糖法制备大鼠肝衰竭模型,建模48h后仍存活的大鼠随机分为6组:模型对照组、黄芪组、鼠外周血单个核细胞组、联合组、联合+环磷酰胺组、联合+地塞米松组。RT-PCR法检测大鼠肝脏组织甲胎蛋白及白蛋白mRNA的表达,观察相关肝功能指标的变化。结果与结论:不同质量浓度的黄芪制剂对人脐血干细胞生长影响不同,200mg/L黄芪最适宜细胞生长和增殖。与单纯加入肝细胞生长因子的人脐血干细胞比较,另加入200mg/L黄芪的人脐血干细胞白蛋白免疫组化染色阳性细胞数明显增加(P<0.05)。随干预时间的延长,联合组、联合+环磷酰胺组、联合+地塞米松组肝脏组织白蛋白mRNA的表达均强于鼠外周血单个核细胞组;而甲胎蛋白mRNA的表达在早期均强于鼠外周血单个核细胞组,在后期则表达消失。干预7d后,联合组、联合+环磷酰胺组、联合+地塞米松组的丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶及总胆红素下降幅度均明显大于模型对照组、黄芪组、鼠外周血单个核细胞组(P<0.05),而此3组间各项指标的变化无明显差异(P>0.05)。提示200mg/L黄芪在体内及体外均可以促进人脐血干细胞生长并分化为肝细胞,减轻肝脏损害,增强脐血干细胞移植治疗肝衰竭的效果。

当归枸杞制剂诱导脐血单个核细胞分化为肝细胞后人白蛋白的表达

背景:部分中药能够促进造血干细胞的生长及分化。目的:观察当归、枸杞制剂促进人脐血单个核细胞生长分化为肝细胞的作用、作用条件及对肝衰竭的治疗效果。方法:分离人脐血单个核细胞,加入不同剂量的当归及枸杞制剂,比较不同剂量当归及枸杞制剂对脐血单个核细胞及其转化为肝细胞后人白蛋白mRNA及人甲胎蛋白mRNA表达的影响。腹腔内注射D-氨基半乳糖建立大鼠肝衰竭模型,随机分为生理盐水对照组、脐血单个核细胞组、脐血单个核细胞与当归、枸杞制剂灌胃和腹腔内注射免疫抑制剂不同组合8组,检测大鼠肝功能变化。结果与结论:90mg/L当归、40mg/L枸杞制剂可促进单个核细胞的增殖和分化,并加快脐血单个核细胞分化为肝细胞,两者联合无药物协同作用。单独应用当归与枸杞对大鼠肝损伤均有一定的修复作用,与单个核细胞联合均可促进单个核细胞向肝细胞分化,增强修复肝损伤的作用,并且当归的修复效果优于枸杞。加用环磷酰胺后并不能增强当归或枸杞联合单个核细胞的治疗效果。

维持性血液透析患者与乙型肝炎病毒感染

乙型肝炎病毒（HBV）感染是最严重危害人类健康公共卫生问题之一，全球约有3．5亿慢性HBV携带者，中国约占其中1／3左右，居世界第一位，其中15％～40％的慢性乙型病毒性肝炎（慢性乙型肝炎）患者将发展为肝硬化和肝细胞癌。血液透析是治疗慢性肾衰竭的有效替代方法之一，维持性血液透析患者HBV感染率明显高于健康人群和慢性肾脏病非透析患者。

更新观念,提高我国肝豆状核变性诊治的临床水平

肝豆状核变性是一少见而可治疗的遗传性疾病,介绍本病最新进展和作者多年的经验,讨论当前我国这一疾病临床中值得注意的问题.大量研究表明,近年本病病例增多,年龄范围更广,肝型及不典型病例更多,诊断难度大,误诊误治常见,值得重视.高度警惕是防止误诊的关键,实验检查是诊断本病不可缺少的依据.K-F环、铜蓝蛋白、尿铜、肝铜、基因检查等对本病的诊断均有重要意义.其中肝铜的特异性和敏感性最高,达95%;基因检查特异性100%,敏感性60%~85%.怀疑本病的患者应进行系统铜代谢检查.严格掌握诊断标准,积分≥4可诊断本病,切勿凭某项指标诊断本病.不论病情轻重,确诊后即开始治疗.危重患者不要因为药物副作用放弃治疗,暴发型应尽快进行快速驱铜治疗,治疗无效的急慢性肝衰竭患者可行肝移植.本病长期预后良好.要认识本病新的特点,更新观念,提高我国肝豆状核变性诊治的临床水平.

人胚胎原始生殖细胞移植治疗大鼠急性肝损伤

目的：胚胎原始生殖细胞能以原始胚胎状态无限增殖,并可通过异体移植或适宜的体外环境自然分化为胚胎生殖层。实验拟进一步观察体外培养的胚胎原始生殖细胞对急性肝损伤大鼠的治疗效果,及其能否在大鼠体内分化为肝细胞。方法：实验于2003-09/2005-05在中南大学肝病研究所完成。①细胞及动物：经中南大学湘雅二医院医学伦理委员会批准,取孕4～12周流产人胚胎,其双亲3代内无遗传性疾病,孕妇对流产胚胎用于实验均签署知情同意书。清洁级健康成年SD大鼠50只,随机数字表法分为5组：培养基对照组、单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组、单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组,10只/组。另选取健康成年SD孕鼠4只用于分离鼠胚原始生殖细胞。动物均由中南大学湘雅二医院动物实验中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：从人胚胎中分离出原始生殖嵴组织,悬浮培养获取人胚原始生殖细胞,用含15%胎牛血清的高糖DMEM基础培养基调节细胞浓度至1×10^8L^-1。取SD孕鼠胚胎分离生殖嵴,消化离心培养鼠胚原始生殖细胞,浓度1×10^8L^-1。各组大鼠均于腹腔内注射D-氨基半乳糖建立急性肝损伤模型,造模后48h,培养基对照组自尾静脉输注基础培养基,其余4组给予对应细胞悬液及免疫抑制剂环磷酰胺。③实验评估：从细胞形态、表面标记及体外分化等方面检测人胚原始生殖细胞的生物学特性;比较各组大鼠肝功能、增殖细胞核抗原阳性率、糖原染色阳性率、肝脏病理改变;检测各组大鼠肝脏病理切片中人白蛋白、甲胎蛋白的表达。结果：①人胚原始生殖细胞的生物学特性：培养1d后单个原始生殖细胞形成细胞集落,以后集落逐渐增大并隆起,形成鸟巢状,周边界限清晰,内部细胞排列紧密。传代后原始生殖细胞集落呈自发分化趋势,周边出现成纤维样细胞,最后分化为梭形细胞、多边形细胞等。原代至第3代未分化的人胚原始生殖细胞集落碱性磷酸酶染色均呈阳性,分化的细胞及成纤维细胞呈阴性。②肝功能检测：细胞输注前各组丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素水平均基本相似（t=0.361～1.183,P均〉0.05）。输注后7d与培养基对照组比较,单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组上述3项指标水平均明显降低（t=2.532～8.361,P均〈0.05）;后两组间比较差异无显著性意义（t=0.340～1.712,P均〉0.05）。③增殖细胞核抗原阳性率：细胞输注后7d与培养基对照组比较,单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组的增殖细胞核抗原阳性率均明显升高（t=9.020～10.747,P均〈0.001）;后两组间比较差异无显著性意义（t=0.752,P=0.462）。④糖原染色：细胞输注后7d,培养基对照组着色相对浅淡,呈细颗粒状,;单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组着色相对深粗,呈斑块状聚集。⑤病理检测：细胞输注后7d,培养基对照组肝索、肝窦结构排列欠规则,坏死区可见少量肝细胞再生,汇管区有大量炎症细胞浸润;单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组各项病理情况均显著改善。⑥大鼠肝组织人白蛋白、甲胎蛋白的表达：细胞输注后14,21d,单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组表达人白蛋白及甲胎蛋白阳性细胞,培养基对照组未见表达。结论：①胚胎原始生殖细胞移植有利于激发急性肝损伤大鼠肝细胞的增殖,改善肝功能,加速受损肝细胞的病理修复。②胚胎原始生殖细胞可在受体肝脏组织中生存,并分化为具有合成白蛋白及甲胎蛋白功能的肝细胞样细胞。

小心误诊害了你

肝豆状核变性是遗传性疾病，发病原因是由于基因突变，患者不能排出体内多余的铜，铜在肝、脑、肾等脏器沉积，引起各个脏器病变。患者表现与肝病、神经病患者很类似，同时还有一些其他症状，如关节疼痛、月经失调、血尿、贫血等。上述三种表现可单独出现，也可先后或同时存在。

丙型肝炎病毒抑制DNA损伤修复相关基因生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45α的表达

目的,探讨HCV感染对DNA损伤修复相关基因生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45仅（GADD45α）表达的影响。方法建立全基因HCVJFH1感染的Huh7．5．1细胞模型。用相对荧光定量PCR和Westernblot分别检测HCVJFHl感染和未感染的Huh7．5．1细胞中GADD45仅mRNA和蛋白质的表达水平。组间数据比较用单因素方差分析。结果HCVJFHl感染的Huh7．5．1细胞内有HCVRNA高水平复制及HCVNS5A蛋白质和核心蛋白的表达。与未感染Huh7．5．1细胞相比，HCVJFH1感染72h的细胞内GADD450α mRNA和蛋白质相对表达量均明显降低，分别为0．57±0．09比1．00±0．11和0．28±0．03比1．00±0．07，差异均有统计学意义（F值分别为75．407和560．04，P值均〈0．01）。结论HCV下调GADD45α的转录和蛋白质表达，影响DNA损伤修复，这可能是HCV感染致肝癌发生的机制之一。

肝豆状核变性诊断指标的意义及其局限性

肝豆状核变性为少见、可用药物治疗、深受关注的遗传性疾病，及时、准确的诊断至关重要。本文介绍本病诊断方面最新进展及其作者多年的经验。临床和常规检查的特点是：年龄范围广，低龄和高龄均不能排除本病；症状轻而体征重，转氨酶和胆红素变化轻而白蛋白和凝血功能变化重等是筛查本病的线索；碱性磷酸酶／总胆红素〈2和门冬氨酸氨基转移酶／丙氨酸氨基转移酶〉2．2有助于暴发型的诊断。在我国，K-F环平均阳性率为72．2％，脑型阳性率为93．4％，显著高于肝型的63．3％，6岁以下儿童少有阳性。铜蓝蛋白阳性率为98．9％，平均为（71．1±48．7）mg／L，约75％患者〈100mg／L，其中约50％患者〈50mg／L。但50％其他原因的肝衰竭患者铜蓝蛋白也可降低，肾病综合征可低于50mg／L；基础尿铜敏感性为86．7％，特异性为78．3％，驱铜试验敏感性（70％）低于基础尿铜；而特异性（97．O％）显著高于基础尿铜。肝铜为诊断本病的金标准，最佳临界值为210ug／g，敏感性为98．9％，特异性为96．0％；近年基因检查技术发展很快，全外显子序列分析已普及，阳性率达90％，特异性几乎为100％；定量诊断是根据诊断指标异常程度将其量化，根据积分判断诊断的可能性，积分≥4，本病可能性大；积分≤1分，可排除本病。定量诊断对于不典型患者和缺乏经验的医生特别有用。但是，如未进行肝铜和基因检查，低积分不能排除本病，慢性胆汁淤积性肝病和本病杂合子合并其他疾病偶尔可≥4，引起假阳性。

暴发性肝豆状核变性的诊断

暴发性肝豆状核变性（fulminant Wilson disease，FWD）是肝豆状核变性病（WD）的一种少见而严重的临床类型，临床表现与其他原因引起的暴发型肝衰竭类似，国内外鲜见从临床、病理和分子生物学多个水平追踪观察的报道。我们对2例典型FWD的临床、病理和基因突变特点进行了分析，以提高对WD的认知性和诊断水平。

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A下调抑癌基因PTEN的表达

目的萤虫素酶探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCVNS5A)对抑癌基因PTEN表达的影响。方法表达HCVNS5A的质粒(pCNS5A)转染QSG-7701细胞,采用间接免疫荧光法观察HCVNS5A蛋白的表达。构建PTEN启动子驱动的萤虫素酶报告基因表达质粒PTEN-Luc,并与pCNS5A共转染QSG-7701细胞,萤虫素酶实验检测HCVNS5A对PTEN启动子活性的影响。采用RT-PCR和Westernblot分析分别观察HCVNS5A对PTENmRNA和PTEN蛋白表达水平的影响。结果转染pCNS5A的QSG-7701细胞胞浆中可见HCVNS5A蛋白表达。PTEN-Luc与不同剂量的pCNS5A质粒共转染QSG-7701细胞,HCVNS5A表达组的PTEN-Luc相对活性下降,且转染HCVNS5A质粒的剂量越大,PTEN-Luc的相对活性越低。转染pCNS5A的QSG-7701细胞内PTENmRNA和蛋白质表达均较对照组下降,且随着HCVNS5A质粒剂量增大,PTENmRNA和PTEN蛋白表达下降更明显。结论 HCVNS5A通过抑制PTEN启动子的活性而抑制PTEN基因的转录和PTEN蛋白的表达,这可能是HCV所致原发性肝细胞癌的发病机制之一。

丙型肝炎病毒非结构蛋白质5A抑制Hepcidin因表达并促进肝细胞内铁储留

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白质5A（NS5A）对Hepcidin基因表达的影响。方法用含HCVNS5A基因的表达质粒pcNS5A瞬时转染QSG7701细胞，采用逆转录-聚合酶链反应及Westemb10t试验观察HCVNS5A和Hepcidin的mRNA转录水平及蛋白质表达水平，铁染色后观察细胞内铁储留情况。检测数据的多组间比较行单因素方差分析，两两比较行LSD-t检验。结果转染pcNS5A质粒细胞内有HCVNS5A的mRNA和蛋白的表达，未转染质粒组和转染空白质粒pRc／CMV组细胞内无HCVNS5A的mRNA和蛋白的表达。未转染质粒组、转染pRc／CMV质粒组和转染pcNS5A质粒组细胞的HeIxzidinmRNA相对表达量分别为0．711±0．049、0．718±0．052和0．264±0．030，转染pcNS5A组HepcidinmRNA表达低于未转染质粒组和转染pRc／CMV质粒组（t值分别为-13．523和-13．045，P值均〈0．01）。转染pcNS5A质粒组细胞HeIxzidin蛋白表达较未转染质粒组及转染pRc／CMV质粒组下降，且随着转染pcNS5A质粒剂量的增加，Hepcidin蛋白表达下降更明显。铁染色结果显示，转染pcNS5A质粒细胞内铁较转染pRC／CMV质粒细胞和未转染质粒细胞高。结论HCVNS5A蛋白能抑制Hepcidin的mRNA和蛋白质表达，并引起细胞内铁的储留增加。